一种重组鸽圆环病毒Cap蛋白的杆状病毒系统表达及该蛋白的应用技术方案

本发明专利技术公开了一种重组鸽圆环病毒Cap蛋白的杆状病毒系统表达及该蛋白的应用，属于基因工程技术领域。鸽圆环病毒Cap蛋白由该病毒Cap基因所编码，所述Cap基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。表达重组鸽圆环Cap蛋白的方法包括：对包含鸽圆环病毒PiCV-zj1的全基因组核苷酸序列设计引物及鸽圆环病毒结构蛋白基因重组质粒为模板的反应体系进行PCR反应处理，得到含有鸽圆环病毒Cap基因的PCR产物；将所述PCR产物克隆到昆虫细胞杆状病毒系统中，得到用于表达重组鸽圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒。本发明专利技术表达的重组Cap蛋白比原核表达产物更接近天然Cap蛋白，且表达效率高、用途广泛。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程学
，具体涉及一种重组鸽圆环病毒Cap蛋白的杆状病毒系统表达及该蛋白的应用。
技术介绍
鸽圆环病毒(Pigeon circovrius，PiCV)感染是一种接触性传染病和免疫抑制病，主要侵害幼鸽。鸽圆环病毒感染于1993年首次报道于美国，此后，加拿大、澳大利亚、英国、德国、比利时、意大利以及法国均有报道。鸽子感染后可以使鸽子出现昏睡、嗜眠、厌食、体重减轻、呼吸窘迫等症状，该病毒作为20世纪90年代新发现的一种病毒，其所导致的疾病已经给养鸽业带来了巨大的经济损失。到目前为止，鸽圆环病毒的发病机制尚不清楚，而且国内外关于此病的研究相对较少，PiCV在中国鸽群的检出引起了兽医工作者的广泛关注，加强有关研究及检测、防疫工作显得非常有必要。PiCV的Cap蛋白是其PiCV病毒的核衣壳蛋白具有抗原性，是病毒抗原的主要成分。目前，国内外对PiCV的Cap蛋白研究较少，主要只是对不同株的PiCV的Cap蛋白序列进行差异分析。而Cap蛋白表达方面目前主要基于大肠杆菌系统原核表达。由于原核表达的蛋白多为包涵体，且后续不能对其表达产物进行相关修饰，如糖基化，甲基化等。因原核表达的Cap蛋白与天然病毒的Cap蛋白相差甚大，不利于对Cap蛋白结构和生物学活性研究。
技术实现思路
为了解决现有技术中Cap蛋白原核表达的蛋白活性远低于天然蛋白活性，不利于对Cap蛋白结构和生物学活性研究，制备的疫苗免疫原性差等问题，本专利技术提供一种重组鸽圆环病毒Cap蛋白及其表达方法。需要说明的是：本专利技术中所述的杆粒，即杆状病毒质粒，英文全称为
Baculovirus plasmid，其英文缩写为Bacmid，是指带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间进行穿梭。重组杆粒是指采用基因工程技术手段将外源基因构建入杆粒而形成的重组杆粒。为实现本专利技术的目的，本专利技术一方面提供一种鸽圆环病毒Cap基因，所述Cap基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。为实现本专利技术的目的，本专利技术在另一方面提供一种重组Cap蛋白，所述Cap蛋白是由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中表达得到的。为实现本专利技术的目的，本专利技术再一方面提供一种鸽圆环病毒结构蛋白基因重组质粒pET-30C-Picv-Cap，所述重组质粒的保藏号为CGMCC NO.11184；保藏时间：2015年9月7日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。为实现本专利技术的目的，本专利技术再一方面提供一种表达重组鸽圆环病毒Cap蛋白的方法，包括：对包含鸽圆环病毒PiCV-zj 1的全基因组核苷酸序列设计引物及鸽圆环病毒结构蛋白基因重组质粒为模板的反应体系进行PCR反应处理，得到含有鸽圆环病毒Cap基因的PCR产物；将所述含有鸽圆环病毒Cap基因的PCR产物克隆到昆虫细胞杆状病毒系统中，得到用于表达重组鸽圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒。特别是，所述的鸽圆环病毒PiCV-zj1毒株的NCBI登录号：DQ090945。尤其是，所述的将所述含有鸽圆环病毒Cap基因的PCR产物克隆到昆虫细胞杆状病毒系统中，得到用于表达重组鸽圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒的步骤包括：利用所述含有鸽圆环病毒Cap基因的PCR产物构建得到含有Cap基因片段重组质粒pF-CP中，将含有Cap基因片段的重组质粒pF-CP转化到DH10Bac中，经蓝白斑筛选得到具有卡那霉素、四环素、庆大霉素抗性的重组杆粒rBacmid-CP；将具有Cap基因片段的重组杆粒转染到昆虫细胞中进行表达，对进行重组
病毒滴度测定试验和用IFA与western blot实验鉴定所述表达得到的产物后，得到能够正常表达重组鸽圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒。尤其是，其中所述引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，具体为：Cap-F：5’-TAAGAATTCCGCTTTATTCACTTTCC-3’；Cap-R：5’-ATACTCGAGCGTCGCAAGGACAAG-3’。特别是，所述昆虫细胞选自sf9、sf21中的一种。特别是，该正常表达重组Cap蛋白的重组杆状病毒的滴度测定结果能达到1×105。为实现本专利技术的目的，本专利技术再一方面还提供一种重组鸽圆环病毒Cap蛋白用于制备鸽圆环病毒亚单位疫苗的用途，包括：将鸽圆环病毒Cap蛋白进行纯化并进一步用来制备鸽圆环病毒亚单位疫苗。为实现本专利技术的目的，本专利技术再一方面还提供一种重组鸽圆环病毒Cap蛋白用于制备检测鸽圆环病毒的Elisa试剂盒的用途。本专利技术的优点：1、杆状病毒系统表达的重组Cap蛋白相比现有技术表达的原核蛋白更接近天然蛋白，有更好的生物活性。杆状病毒拥有众多优点，杆状病毒感染昆虫细胞后，昆虫细胞对外源蛋白进行相应的加工修饰，对这些加工包括酰基化、糖基化、磷酸化以及蛋白的折叠作用，表达的产物具有良好的生物学活性。2、由于杆状病毒系统表达的重组Cap蛋白具有空间构型，更接近天然的PiCV的Cap蛋白构象，可用来研究PiCV的Cap蛋白结构解析。此外，Cap蛋白在致病性和诱导机体保护性免疫应答起重要作用。可利用杆状病毒表达的Cap蛋白开发为鸽圆环病毒亚单位疫苗或者用于检测试剂盒的研制。附图说明图1是本专利技术实施例中Cap基因的扩增结果图。其中，第一泳道PCR的扩增产物电泳图，第二泳道为DL 2000DNA Marker；图2是本专利技术实施例中重组质粒pF-CP酶切鉴定。其中，第一泳道为DL 5000DNA Marker，第二泳道为重组质粒pF-CP双酶切产物pF-CP/EcoRI+XhoI；图3是本专利技术实施例中rBacmid-CP的PCR鉴定结果图。其中，第一泳道
rBacmid-CP的PCR扩增产物电泳图，第二泳道为未插入外源基因的Bacmid的PCR扩增产物电泳图，第三泳道DL 2000DNA Marker；图4是本专利技术实施例中重组杆状病毒感染的细胞病变(×100)。其中，图片1重组杆状病毒感染的sf9细胞，图片2为正常sf9细胞；图5是本专利技术实施例中Western blot表达产物的分析。其中，第一泳道为M蛋白分子量标准Marker，第二泳道为正常的sf9细胞上清，第三泳道为Bacmid转染sf9细胞上清，第4-5泳道为rbacmind-CP转染sf9细胞上清；图6是本专利技术实施例中IFA检测结果(×100)。其中，图片1为rbacmid-CP转染sf9细胞，图片2为Bacimd转染sf9细胞，图片3为正常的sf9细胞。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1实验材料：鸽圆环病毒结构蛋白基因重组质粒pET-30C-Picv-Cap(内蒙古金凯默生物科技公司)，所述重组质粒的保藏号为CGMCC NO.11184；保藏时间：2015年9月7日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸽圆环病毒Cap基因，其特征在于，所述Cap基因如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种鸽圆环病毒Cap基因，其特征在于，所述Cap基因如SEQ ID NO.1所示。2.一种重组鸽圆环病毒Cap蛋白，其特征在于，该Cap蛋白是将所述序列为SEQ ID NO.1所示的Cap基因克隆到昆虫细胞杆状病毒系统中表达而得到的。3.一种鸽圆环病毒结构蛋白基因重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的保藏号为CGMCC NO.11184；保藏时间：2015年9月7日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。4.一种表达权利要求2的重组鸽圆环病毒Cap蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：对包括鸽圆环病毒PiCV-zj1的全基因组核苷酸序列设计引物及权利要求3所述的鸽圆环病毒结构蛋白基因重组质粒为模板的反应体系进行PCR反应处理，得到含有鸽圆环病毒Cap基因的PCR产物；将所述含有鸽圆环病毒Cap基因的PCR产物克隆到昆虫细胞杆状病毒系统中，得到用于表达重组鸽圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的将所述含有鸽圆环病毒Ca...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建军，徐秉亮，赵文广，
申请(专利权)人：内蒙古金凯默生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15