本发明专利技术公开一种大鲵虹彩病毒病疫苗及制备方法和应用。本发明专利技术的大鲵虹彩病毒病疫苗为将大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白基因截短优化后翻译的重组蛋白，其序列为SEQIDNO.2所示。将该蛋白对应的核苷酸序列按酵母密码子偏好性进行优化，合成该基因片段，转入酵母表达载体，通过高拷贝克隆的筛选，最终获得了一株高表达的重组蛋白的巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCPPichiapastorisKm71/GSIV-MCP，CCTCC NO：M2014573。利用该酵母发酵生产的蛋白具备活性高，产量大的特点。通过免疫保护实验确定了该抗原蛋白能有效的预防大鲵虹彩病毒病。
【技术实现步骤摘要】
一种大鲵虹彩病毒病疫苗及制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种大鲷虹彩病毒病疫苗及制备方法和应用。
技术介绍
中国大鲷（Andrias davidianus)是现存个体最大的两栖动物，俗名娃娃鱼，是 我国的珍贵特产，属于国家二级保护动物。近年来在我国的陕西、湖北、湖南、浙江、贵州等 省份的大鲷主养区暴发了大鲷病毒性出血病，该病可感染各种规格的养殖大鲷，死亡率高 达90 %以上，给大鲷养殖业造成了巨大的经济损失。 大鲷病毒性出血病的病原为大鲷虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，GSIV)，是虹彩病毒科（Iridoviridae)，娃病毒属（Ranavirus)的成员。虹 彩病毒（Iridoviruses)是一类病毒粒子较大，呈二十面体状的双链DNA病毒。虹彩 病毒科（Iridoviridae)分为五个属：绿虹彩病毒属（Chloriridovirus),虹彩病毒属 (Iridovirus)，淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus)，巨大细胞病毒属（Megalocytivirus) 和蛙病毒属（Ranavirus)。虹彩病毒可感染无脊椎动物（绿虹彩病毒属，虹彩病毒属）及变 温脊椎动物（蛙病毒属，淋巴囊肿病毒属，巨大细胞病毒属），包括两栖类、爬行类、甲壳类、 软体动物、昆虫及鱼类等。脊椎动物虹彩病毒，尤其是蛙病毒属的一些成员已经成为导致变 温动物发病的一个重要原因。主要衣壳蛋白（Major Capsid Prote in，MCP)基因为虹彩 病毒的一个晚期基因，在虹彩病毒感染的晚期大量表达，编码的主要衣壳蛋白分子量约为 50kD，构成病毒的二十面体衣壳。比较虹彩病毒MCP基因的氨基酸序列发现，虹彩病毒MCP 基因的氨基酸序列是高度保守的，同一属的同源性一般在90%以上，不同属之间的同源性 一般为40% -50%左右。很多【专利技术者】针对各自虹彩病毒MCP制备疫苗，但通过体外重组表 达全长MCP作为疫苗，因生产过程中MCP表达量少，导致制备成本增加。本专利技术通过对大鲷 虹彩病毒MCP蛋白进行分析，选择亲水性和抗原性强的区域表达制备疫苗。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)是一种新型真核表达系统，能稳定高效表达 外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目的 蛋白的工业化生产提供了保障。自1984年应用毕赤酵母表达外源蛋白以来，已有400多种 蛋白在该系统中成功表达，部分成果已进入商品化生产。 由于遗传密码具有简并性，一种氨基酸可以有1-6个使用频率不同的同义密码 子。对于特定的物种，高表达的基因往往使用部分特定的同义密码子，这些密码子被认为是 该物种高表达基因的优越密码子，这种现象称为密码子偏爱性。密码子的偏爱性使得克隆 的外源基因往往难以在异种生物细胞高效表达。在酵母中获得高效表达的外源基因往往 都是酵母偏爱密码子所编码的基因，通过对酵母基因使用密码子的统计分析证实所有的61 个密码子中有25个是酵母所偏爱的，因此对密码子进行偏爱性改造能大量提高重组蛋白 在该系统中的表达量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种大鲷虹彩病毒病疫苗，该疫苗为大鲷虹彩病毒主 衣壳蛋白截短优化的重组蛋白，其序列为SEQ ID NO. 2所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。 本专利技术的另一个目的在于提供了一种大鲷虹彩病毒病疫苗的制备方法， 申请人:提 供了一株巴斯德毕赤酵母 Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP 菌株，该菌株 包含有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，将该菌株发酵可制备大鲷虹彩病毒病疫苗。该菌 株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO :M2014573， 分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP，地址：中国 武汉武汉大学。 本专利技术的最后一个目的在于提供了一种大鲷虹彩病毒病疫苗在制备大鲷虹彩病 毒疫苗中的应用。 为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施： 一种大鲷虹彩病毒病疫苗的获得： 分析Genbank公布的大鲷虹彩病毒主衣壳蛋白基因（JN615141. 1)，找到亲水性和 抗原性强的区域，按酵母密码子偏好性进行优化，合成该基因片段，其序列为SEQ ID NO. 1 所示，根据优化片段的基因序列设计引物（JDMCP1F和JDMCP1R)进行PCR反应，克隆获得截 短优化的主衣壳蛋白基因，转入酵母表达载体，获得重组表达载体，然后再将其导入酵母表 达菌种，筛选高拷贝克隆，获得重组毕赤酵母表达菌，该菌株已于2014年11月18日保藏于 中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC N0:M2014573,分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/ GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP，地址：中国武汉武汉大学。 上述巴斯德毕赤酵母 Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP CCTCC N 0 :M2014573的菌学特征为：该酵母菌是单细胞真核生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单 体，可在含有2mg/mL Zeocin抗生素的YPDS平板上培养，液体培养条件下以单细胞形式存 在，固体培养时。呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑、为乳白色。依次通过BMGY和BMMY培养 基培养后，上清液中含有大鲷虹彩病毒主衣壳蛋白部分结构蛋白。 上述巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCP Pichia pastoris Km71/GSIV-MCP 的构建方 法具体为： 1)合成SEQ ID NO. 1所示为截断的MCP基因的核苷酸序列。 2)引物设计 JDMCPIF :5' -CGGAATTCCGTATGACAACTTGG-3' (含 EcoR I 酶切位点） JDMCP1R :5' -TCCCCGCGGCATTGTGCATAGGG-3' (含 Sac II 酶切位点）。 3) PCR获取截断MCP基因 以JDMCP1F/JDMCP1R为引物，合成的的截断MCP基因为模板进行PCR，回收PCR产 物。 4)将获取的目的基因克隆入pPICZa B表达载体并进行序列测定 PCR产物和pPICZa B均用EcoR I、Sac II双酶切，T4DNA连接酶连接，连接产物 转化E. coli DH5a感受态细胞，从含25 μ g/mL Zeocin的LB平板上挑取单克隆，小量 提取质粒，用酵母特异引物 5' -AOX (5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'）和 3' -AOX (5' -GCA AATGGCATTCTGACATCC-3'）进行PCR鉴定，同时进行Sac II单酶切，EcoR I、Sac II双酶切鉴 定。阳性连接产物命名为：pPICZ a B-GSIV-MCP。 5)电转酵母菌及转化子的筛选 重组质粒pPICZ a B本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1. 一种分离的基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示。2. 含有权利要求1所述基因的毕赤酵母。3. -种基因工程菌，其特征在于：巴斯德毕赤酵母Km71/GSIV-MCP PicAia paWoris Km71/GSIV-MCP, CCTCC NO ：M2014573〇4. 一种制备大鲷虹彩病毒病疫苗的方法，具体如下： 将巴斯德毕赤酵母 Km71/GSIV-MCP PicAia paWoris Km71/GSIV-MCP 接种到 100mL BMGY培养基中，30°C、250r/min振荡培养至0D_值达6左右，室温1500g...
【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，曾令兵，范玉顶，徐进，马杰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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