一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因、其改造方法及应用，包括PCV2ORF2基因序列的来源及改造、引物的设计与合成、PCV2 ORF2短片段DNA的合成、全长基因的合成及合成后序列、表达载体的构建和目的基因在毕赤酵母中的表达等步骤。本发明专利技术综合参考了PTDS法和PAS法，使基因合成费用降低，步骤简单(两步PCR)，错误率低，合成周期短。在整个化学合成的过程中，运用了高保真的Taq酶，使误配的碱基序列能够在合成过程中得以修正，从而最大限度的减少了错误碱基的产生。将该基因克隆入酵母表达载体构建重组表达质粒，重组表达质粒规模发酵后提取的表达产物，可作为检测PCV2抗体的诊断抗原，也可制备亚单位疫苗或核酸疫苗。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因、其改造方法及应用，包括PCV2ORF2基因序列的来源及改造、引物的设计与合成、PCV2?ORF2短片段DNA的合成、全长基因的合成及合成后序列、表达载体的构建和目的基因在毕赤酵母中的表达等步骤。本专利技术综合参考了PTDS法和PAS法，使基因合成费用降低，步骤简单(两步PCR)，错误率低，合成周期短。在整个化学合成的过程中，运用了高保真的Taq酶，使误配的碱基序列能够在合成过程中得以修正，从而最大限度的减少了错误碱基的产生。将该基因克隆入酵母表达载体构建重组表达质粒，重组表达质粒规模发酵后提取的表达产物，可作为检测PCV2抗体的诊断抗原，也可制备亚单位疫苗或核酸疫苗。【专利说明】化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法和应用
本专利技术涉及一种蛋白，尤其涉及一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改 造方法和应用。
技术介绍
猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV)分为PCV1和PCV2两种基因型，其 中PCV2有致病性，可引起猪断奶后多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，还是育肥猪的猪皮炎和肾病综合征（Porcine Dermatitis and Nephropathy SyndromeJDNS)的主要病因。由于该病属于免疫抑制疾病，可引发严重的继 发感染从而危害猪群健康，是继猪繁殖与呼吸综合征之后又一个严重危害全球养猪业的重 大疾病，在我国规模化猪群中PCV2感染率超过90%。近两年在国际上已获得批准的猪圆环 病毒疫苗有4个，其中2个是通过基因工程技术手段研制的疫苗，但其技术手段均获得了严 格的国际专利保护，这给研发新型PCV2疫苗设置了较高的门槛。猪圆环病毒2型基因工程 疫苗研究的难点是如何提蛋白产量和免疫原性，国际上已有很多研究利用大肠杆菌、杆状 病毒和腺病毒系统表达的产物进行免疫原性评估，在产量和免疫原性上很难两全。目前，国 内外尚无利用毕赤酵母表达系统制备基因工程疫苗。 毕赤酵母（Pichia pastoris)表达系统经过近十年发展，已成为较完善的外源基 因表达系统，已高效表达了 HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素 C片段、基因工程抗体等多种外源 基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的 外源基因表达系统，而且非常适宜于扩大为工业规模。酵母系统具有操作简单、产量高、对 蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能的优点。
技术实现思路
本专利技术的目的，就是为了解决现有技术存在的上述问题，提供一种化学合成的猪 圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法和应用。 为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种化学合成的猪圆环病毒 Cap蛋白基因及其改造方法，包括以下步骤： 1)PCV2 0RF2基因序列的来源及改造 运用 DNAstar (DNASTAR，Inc.)、RNA structure (Rochester University)软件对猪 圆环病毒0RF2的RNA的复杂二级结构进行了分析，对基因进行同义改造得到毕赤酵母密码 子优化的0RF2编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 2)引物的设计与合成 设计了 18条引物，记为引物1-18,用于化学合成0RF2基因序列，引物1-18对应的 序列如SEQ ID NO. 2-SEQ ID N0. 19所示；相邻的引物方向相反而且重复序列21bp ; 3) PCR扩增400bp片段和300bp片段 将步骤2)中所述18条引物分别以ddH20溶解至终浓度30 μ Μ ;分为两组，第一组 为引物1-10,第2组为引物11-18 ; 400bp片段的扩增：将第一组中的引物2-9各取5 μ L混合，加入10 μ LddH20混合 均勻，取1 μ L作为扩增模板；以引物1和10为primer扩增400bp片段； 300bp片段的扩增：将第二组中的引物12-17各取5 μ L混合，加入20 μ LddH20混 合均匀，取1 μ L作为扩增模板；以引物11和18为primer扩增300bp片段； 两个片段的PCR扩增的反应程序为；94°C预变性5min，然后94°C变性30s，55°C退 火30s，72°C延伸60s，扩增30个循环之后，72°C延伸lOmin ; 4)全长基因的合成 取上述400bp片段和300bp片段为模板，以SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 19所示的 序列为引物，进行PCR反应，一次性合成0RF2基因； 5)表达载体的构建 设计6条引物，分别扩增Cap基因密码子优化前、后全长以及不含信号肽的四种基 因片段，将四种基因片段分别与毕赤酵母表达载体连接，构建四种重组表达载体，6条引物 的序列如 SEQ ID NO. 20-SEQ ID N0. 25 所示； 6)目的基因在毕赤酵母中的表达 将构建好的四种重组表达载体，电转化进入野生型毕赤酵母菌GS115中，经 Zeocin抗性筛选后获得大量多拷贝重组子；经甲醇诱导，SDS-PAGE和Western-blot分析结 果表明，能够分泌表达的只有经密码子优化且含有目的基因信号肽的重组子，目的蛋白分 子质量约为30KDa，免疫印迹试验能与多抗及单抗发生反应。 步骤4)所述PCR反应的反应体系为： 反应体系如下： 【权利要求】1. 一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1. PCV2 0RF2基因序列的来源及改造 运用 DNAstar(DNASTAR，Inc.)、RNA structure (Rochester University)软件对猪圆环 病毒0RF2的RNA的复杂二级结构进行了分析，对基因进行同义改造得到毕赤酵母密码子优 化的0RF2编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 2) 引物的设计与合成 设计了 18条引物，记为引物1-18,用于化学合成0RF2基因序列，引物1-18对应的序列 如SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 19所示；相邻的引物方向相反而且重复序列2Ibp ; 3. PCR扩增400bp片段和300bp片段 将步骤2)中所述18条引物分别以ddH20溶解至终浓度30 μ Μ ;分为两组，第一组为引 物1-10,第2组为引物11-18 ; 400bp片段的扩增：将第一组中的引物2-9各取5 μ L混合，加入10 μ LddH20混合均匀， 取1 μ L作为扩增模板；以引物1和10为primer扩增400bp片段； 300bp片段的扩增：将第二组中的引物12-17各取5 μ L混合，加入20 μ LddH20混合均 勻，取1 μ L作为扩增模板；以引物11和18为primer扩增300bp片段； 两个片段的PCR扩增的反应程序为：94°C预变性5min，然后94°C变性30s，55°C退火 3〇8,721：延伸6〇8，扩增30个循环之后，721：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，其特征在于，包括以下步骤：1)PCV2 ORF2基因序列的来源及改造运用DNAstar(DNASTAR，Inc.)、RNA structure(Rochester University)软件对猪圆环病毒ORF2的RNA的复杂二级结构进行了分析，对基因进行同义改造得到毕赤酵母密码子优化的ORF2编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；2)引物的设计与合成设计了18条引物，记为引物1‑18，用于化学合成ORF2基因序列，引物1‑18对应的序列如SEQ ID NO.2‑SEQ ID NO.19所示；相邻的引物方向相反而且重复序列2Ibp；3)PCR扩增400bp片段和300bp片段将步骤2)中所述18条引物分别以ddH2O溶解至终浓度30μM；分为两组，第一组为引物1‑10，第2组为引物11‑18；400bp片段的扩增：将第一组中的引物2‑9各取5μL混合，加入10μLddH2O混合均匀，取1μL作为扩增模板；以引物1和10为primer扩增400bp片段；300bp片段的扩增：将第二组中的引物12‑17各取5μL混合，加入20μLddH2O混合均匀，取1μL作为扩增模板；以引物11和18为primer扩增300bp片段；两个片段的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，扩增30个循环之后，72℃延伸10min；4)全长基因的合成取上述400bp片段和300bp片段为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.19所示的序列为引物，进行PCR反应，一次性合成ORF2基因；5)表达载体的构建设计6条引物，分别扩增Cap基因密码子优化前、后全长以及不含信号肽的四种基因片段，将四种基因片段分别与毕赤酵母表达载体连接，构建四种重组表达载体，6条引物的序列如SEQ ID NO.20‑SEQ ID NO.25所示；6)目的基因在毕赤酵母中的表达将构建好的四种重组表达载体，电转化进入野生型毕赤酵母菌GS115中，经Zeocin抗性筛选后获得大量多拷贝重组子；经甲醇诱导，SDS‑PAGE和Western‑blot分析结果表明，能够分泌表达的只有经密码子优化且含有目的基因信号肽的重组子，目的蛋白分子质量约为30KDa，免疫印迹试验能与多抗及单抗发生反应。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张春玲，于瑞嵩，倪建平，李春华，李震，何锡忠，蒋凤英，张婉华，董世娟，周宗清，彭丽英，张俊平，
申请(专利权)人：上海佳牧生物制品有限公司，上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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