甲基-β-环糊精在提高杆状病毒外源蛋白表达量中的应用制造技术

甲基‑β‑环糊精在提高杆状病毒外源蛋白表达量中的应用，本发明专利技术用一定浓度MβCD孵育用于表达外源蛋白的细胞，能显著的提高昆虫杆状病毒感染效率并提高外源蛋白的表达量。本发明专利技术可明显改善杆状病毒表达系统的表达效率，同时MβCD本身易溶于水和有机溶剂，已经广泛的应用于药品和食品行业，具有良好安全性，因此应用杆状病毒表达药用蛋白同样可以应用本方法。本发明专利技术提供的方法容易理解，操作简单易行，效果明显。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病毒学领域以及蛋白质表达系统领域，涉及甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin，简称MβCD，也有表示为MBCD，Me-βCD，MeBCD)提高昆虫杆状病毒入侵效率，进而提高外源蛋白表达量的具体应用方法。
技术介绍
杆状病毒是一类具有囊膜的双链DNA病毒，自然界中主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫。自Smith等人首次利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)作载体成功表达人β-干扰素以来，至今已用杆状病毒表达的蛋白有千种(Acharya A,Sriram S&Saehrawat S.Bombyx mori nucleopolyhedrovirus molecular biology and biotechnological applications for large-scale synthesis of recombinant proteins.Curr Sci 2002,83:455–465.)，目前应用的昆虫杆状病毒表达系统主要有AcMNPV和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)，由于杆状病毒具有强大多角体启动子及P10启动子，表达的外源蛋白具有较好的修饰加工，具有良好的生物学活性，而且其基因组可以插入较大片段外源DNA等，所以昆虫杆状病毒表达系统已被公认为是优良的真核表达系统。近年来，利用重组杆状病毒生产的药物及疫苗已经上市，例如利用杆状病毒表达系统生产的人乳头瘤病毒疫苗(CervarixTM，葛兰素史克)已经上市，并取得非常好的免疫效果。为了更好的利用杆状病毒表达外源蛋白，国内外许多学者致力于如何提高其表达量方面的研究：法国学者将病毒中组织蛋白酶基因、几丁质酶基因和p10基因破坏以增加表达量(专利：改进的杆状病毒表达系统，公开号：103748229A)；美国科学家通过利用多种信号肽改变外源蛋白加工与分泌(专利：Method to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems.United States.Patent 5278050)以提高表达量。一系列经过改造的杆状病毒在应用中都需要通过重组病毒的繁殖、大量扩增环节，才能应用于外源蛋白的表达，在重组病毒制备及扩增过程中，需要消耗大量的人力财力，如果能在病毒感染的过程中，应用一定手段提高感染效率、进而提高其表达量，可节省人力物力，降低成本，达到事半功倍的效果。MβCD，是β-环糊精(β-CD)的烷基化衍生物，白色粉末，无毒、无嗅、微甜，易溶于水和有机溶剂，在食品及药物中得到了广泛应用。谢伯泰等综述了MβCD在口服药、鼻腔喷雾剂、栓剂以及透皮吸收剂方面的应用前景，并且指出MβCD是毒性比较小的药物稳定剂、增溶剂及吸收促进剂，但要注意MβCD使用剂量，以保证其具有较好的安全性(谢伯泰,马晓明,姚孙贤,谢薇梅.甲基化-β-环糊精的特性及其在药物中的应用.中国新药杂志2009年第18卷第8期705-709.)。本课题组前期在研究杆状病毒入侵过程时发现MβCD在较高浓度下，可以抑制BmNPV感染BmN细胞，正是在运用一系列的连续浓度梯度MβCD研究抑制入侵的过程中，意外的发现当使用低浓度MβCD时，非但没有抑制病毒的感染，反而增强病毒的感染性，最终增加了杆状病毒的对外源蛋白的表达量。利用MβCD提高杆状病毒感染率及外源蛋白表达量方面还没有报道，所以本专利技术是首次对这种提高杆状病毒表达载体外源蛋白表达量的方法做具体报道。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术的目的是提供一种化学药物——MβCD的新用途，提供应用一定浓度的甲基-β-环糊精提高杆状病毒外源蛋白表达量的新方法，该方法简便，成本低廉，易于操作推广。技术方案：甲基-β-环糊精在提高昆虫杆状病毒表达系统外源蛋白表达量中的应用。所述昆虫杆状病毒为AcMNPV病毒或BmNPV病毒。所述表达系统为sf21、sf9或BmN细胞。所述表达系统为贴壁培养及悬浮培养的细胞。所述甲基-β-环糊精的工作浓度为0.125-2mM。甲基-β-环糊精在提高昆虫杆状病毒入侵宿主细胞的效率的应用。提高昆虫杆状病毒表达系统外源蛋白表达量的组合物，有效成分包括甲基-β-环糊精。1.MβCD(购自Sigma公司)溶液的配制及杆状病毒准备用1×PBS溶解MβCD，配制浓度为50～100mM的储存液备用。将重组杆状病毒感染敏感宿主细胞，感染后60-96h收获出芽病毒(Budded virus，BV)，用终点稀释法测定病毒滴度，4℃避光保存用于后续研究。2.细胞的孵育将对数生长期的昆虫细胞接种到培养皿/板中，不同细胞株保持其最适密度，比如sf21和sf9保持在约5×104个细胞/cm2，BmN细胞约1×104个细胞/cm2，贴壁12-24h后，用配制好的MβCD储存液加入到贴壁昆虫细胞培养液中，使MβCD终浓度分别为0.125～2mM，孵育10-120min，孵育细胞温度为24-29℃，以0mM MβCD(即等体积1×PBS)孵育液作为对照。孵育时间到后，分别去除(或者不去除)1×PBS和不同浓度的MβCD孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次。3.病毒感染效率分析及外源蛋白表达量分析接着用感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.01～50的杆状病毒感染相应的宿主细胞，感染60-120min后，除去病毒液，用无血清培养基轻轻洗涤细胞两次(也可不洗)，加入正常的培养基，感染后6h利用流式细胞仪分析被感染细胞中荧光表达效率，确定病毒感染效率。外源蛋白表达量分析则收集感染后24-120h细胞样品，检测细胞中表达的荧光素酶活性，比较不同处理间荧光素酶相对活性差异。有益效果：本专利技术首次发现MβCD的一种新用途。用一定浓度MβCD孵育用于表达外源蛋白的细胞，能显著的提高昆虫杆状病毒感染效率并提高外源蛋白的表达量。当用0.25mM MβCD孵育BmN细胞时，BmNPV病毒感染的细胞数量提高了35％左右，而荧光素酶的活性比对照提高了799％，其它浓度的增强效果也达到极显著水平；AcMNPV入侵效率提高了51％。本专利技术公开的用途，可明显改善杆状病毒表达系统的表达效率，同时MβCD本身易溶于水和有机溶剂，已经广泛的应用于药品和食品行业，具有良好安全性，因此应用杆状病毒表达药用蛋白同样可以应用本方法。本专利技术提供的方法容易理解，操作简单易行，效果明显。附图说明图1.不同浓度MβCD预处理sf21细胞对AcMNPV病毒感染率分析图。分别用终浓度为0mM(等体积的1×PBS作为对照，CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM的MβCD处理30min后，再用AcBac-egfp感染(MOI＝5)1h，去除感染液后正常培养。6h后用流式细胞仪检测细胞相对感染率，其中CTRL感染率设为100％，其他各处理相对感染率如图所示，*表示与对照相比较差异显著(P<0.05本文档来自技高网...

【技术保护点】
甲基‑β‑环糊精在提高昆虫杆状病毒表达系统外源蛋白表达量中的应用。

【技术特征摘要】
1.甲基-β-环糊精在提高昆虫杆状病毒表达系统外源蛋白表达量中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述昆虫杆状病毒为AcMNPV病毒或BmNPV病毒。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述表达系统为sf21、sf9、High five(Hi5)或BmN细胞。4.根据权利要求3所述的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金山，郝碧芳，南文斌，柳林，沈兴家，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32