本发明专利技术公开了一种表达载体，包含至少一个调控单元，其含有增强子和启动子：增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体，或Act5C启动子或其功能片段或序列变体；其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强子，或AcMNPV中的hr3增强子；所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子诱导；所述的Act5C启动子为果蝇细胞中的Actin 5C启动子。所述表达载体可在果蝇S2细胞高效表达。本发明专利技术构建了一个能够在双翅目昆虫果蝇S2细胞上高效表达的含鳞翅目杆病毒基因hr5增强子的重组蛋白表达载体，克服了现有技术中由于种属隔离的原因，杆病毒不在双翅目昆虫中传播的技术偏见。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种表达载体及其应用。
技术介绍
一些培养的昆虫细胞系是各种研究应用以及作为疫苗的病毒类颗粒(VLP)的重组蛋白异源表达的重要宿主(Cherezov等，2007；Imasaki等人，2011；Rasmussen等人，2007；White等人，2012)，(Metz和Pijlman，2011；Shrestha等人，2007；Treanor等人，2011；Treanor等人，2011年)。这些工艺主要利用杆状病毒表达载体系统(BEVS)来感染源自鳞翅目的细胞系。(Berger等人，2004；Jarvis，2009；Kost等人，2005；Summers，2006)。我们发现鳞翅目杆病毒同源区域5(homologous region 5)增强子(hr5增强子)用于鳞翅目昆虫细胞的高效表达载体，可以显著提高鳞翅目昆虫细胞的重组蛋白表达能力。而S2(Drosophila Schneider 2)细胞是一种果蝇细胞，属于双翅目果蝇科果蝇属的一种昆虫细胞，通常由于种属隔离，应用于不同种属的重组表达载体通常无法通用，杆病毒是专门针对性的传染鳞翅目昆虫，通常不在双翅目昆虫中传播。即在鳞翅目昆虫细胞中高效表达的表达载体，无法在双翅目昆虫细胞中有效表达。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种表达载体及其应用，通过构建了一个 在双翅目昆虫果蝇S2细胞上高效表达的含鳞翅目杆病毒基因hr5增强子的重组蛋白表达载体，克服了现有技术中杆病毒不在双翅目昆虫中传播的技术偏见。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有增强子和启动子：其中，增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体，或Act5C启动子或其功能片段或序列变体；其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强，或AcMNPV中的hr3增强子；所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子诱导；所述的Act5C启动子为果蝇细胞中的Actin 5C启动子。进一步地，所述hrx增强子与MT启动子或Act5C启动子连接。进一步地，作为优选方案，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子。更进一步地，hr5增强子采用如SEQ NO ID.2第1-482位所示序列或与其具有70％以上同源的序列。进一步地，所述MT启动子功能片段为SEQ NO ID.1第1-422位所示序列或与其具有70％以上同源的序列。进一步地，所述Actin 5C启动子功能片段为SEQ NO ID.3第3411-3711位所示序列或与其具有70％以上同源的序列。上述表达载体可在果蝇S2细胞中应用，以果蝇S2细胞作为宿主细胞，所述果蝇S2细胞中包含有所述表达载体。上述所述的表达载体的构建方法如下：当启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体时：1)使用特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His的模板上扩增MT，扩增产物使用SapI和NotI消化并在质粒pIEx-10亚克隆产生pMT；该特异性寡核苷酸引物为：5’-AAG CTC TTC TTG CAG GAC AGG ATG TGG T-3’；5’-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-3’；2)使用另一特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His的模板上扩增MT并用NheI和NotI酶切在质粒pIEx-10中亚克隆产生phrMT；质粒phrMT即为所要构建的表达载体，其中保留了hr5增强子和MT启动子；该另一特异性寡核苷酸引物如下：5’-AAA GCT AGC TTG CAG GAC AGG ATG TGG TG-3’；5’-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-3’；当启动子为Act5C启动子或其功能片段或序列变体时：1)在pUC-Act的模板上采用如下引物进行扩增Act5C：5’-AAG CTC TTC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-3’；5’-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3’；扩增产物使用SapI和NotI消化并在质粒pIEx-10中亚克隆产生pAct5C；2)在pUC-Act的模板上采用如下引物扩增Act5C：5’-AAA GCT AGC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-3’；5’-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3’；扩增产物并用NheI和NotI酶切在质粒pIEx-10中亚克隆产生质粒phrAct5C，即为所要构建的表达载体，其中保留了hr5增强子和Act5C启动子。本专利技术的有益效果在于：本专利技术构建了一个能够在双翅目昆虫果蝇S2细胞上高效 表达的含鳞翅目杆病毒基因hrx增强子的重组蛋白表达载体，克服了现有技术中由于种属隔离的原因，杆病毒不在双翅目昆虫中传播的技术偏见。附图说明图1为包含hr5增强子和MT启动子的表达载体，其中hr5增强子和MT启动子相连。图1中表达载体还包含了NotI及BamHI酶切位点以及终止子和抗性基因等部件；图2为包含hr5增强子和Act5C启动子的表达载体，其中hr5增强子和Act5C启动子相连。图2中表达载体还包含了SbfI和SphI酶切位点以及终止子和抗性基因等部件；图3为瞬时表达的EGFP阳性细胞比例示意图；图4为瞬时表达的EGFP相对荧光单位示意图；图5为稳定表达的EGFP相对荧光单位；图6为瞬时表达的TNFR-Fc产量；图7为稳定表达的TNFR-Fc产量和稳定性；图8为hr5增强子对MT启动子和Act5C启动子的相对产量影响；图9为每周取样通过夹心酶联免疫分析(sandwich ELISA)测定TNFR-Fc产量的结果示意图；图10为hr5增强子对MT启动子及Act5C启动子的相对蛋白产量的增强作用示意图。具体实施方式以下将结合附图对本专利技术作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技 术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围并不限于本实施例。实施例1一种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有增强子和启动子：其中，增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体，其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强，或AcMNPV中的hr3增强子；所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子诱导；进一步地，所述hrx增强子与MT启动子连接。进一步地，作为优选，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子。更进一步地，hr5增强子采用如SEQ NO ID.2第1-482位所示序列或与其具有70％以上同源，优选80％以上同源，更优选90％以上同源，更优选95％以上同源，最优选98％以上同源的序列。进一步地，所述MT启动子功能片段为SEQ NO ID.1第1-422位所示序列或与其具有70％以本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达载体，包含至少一个调控单元，其特征在于，所述调控单元含有增强子和启动子：其中，增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体，或Act5C启动子或其功能片段或序列变体；其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强子，或AcMNPV中的hr3增强子；所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子诱导；所述的Act5C启动子为果蝇细胞中的Actin 5C启动子。
【技术特征摘要】
1.一种表达载体，包含至少一个调控单元，其特征在于，所述调控单元含有增强子和启动子：其中，增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体，或Act5C启动子或其功能片段或序列变体；其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强子，或AcMNPV中的hr3增强子；所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子诱导；所述的Act5C启动子为果蝇细胞中的Actin 5C启动子。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述hrx增强子与MT启动子或Act5C启动子连接。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子。4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，hr5增强子采用如SEQ NO ID.2第1-482位所示序列或与其具有70％以上同源的序列。5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述MT启动子功能片段为SEQ NO ID.1第1-422位所示序列或与其具有70％以上同源的序列。6.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述Actin 5C启动子功能片段为SEQ NO ID.3第3411-3711位所示序列或与其具有70％以上同源的序列。7.如权利要求1-6任一所述的表达载体在果蝇S2细胞中的应用，其特征在于，以果蝇S2细胞作为宿主细胞，所述果蝇S2细胞中包含有所述表达载体。8.如权利要求1-6任一所述的表达载体的构建方法，其特征在于，当启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体时：1)使用特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His的模板上扩增MT，...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈潇，林兴华，
申请(专利权)人：广州汉腾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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