本发明专利技术公开了一种基于双链微载体将CAR基因定点整合至T细胞AAVS1位点的方法，其包括用来携带CAR基因的双链微载体，命名为CELiDCAR；帮助微载体定点整合至人19号染色体AAVS1位点的质粒，命名为pCMV-Rep；载体体外共转染人T细胞的方法；T细胞体外筛选扩增的方法；定点整合CAR-T细胞的功能鉴定方法。本发明专利技术可实现CAR基因在T细胞内的定点整合于19号染色体AAVS1位点的人T细胞，改造过的人T细胞能够表达CAR受体，在体外激活试验中能够识别其特异性的抗原并激活T细胞，从而本发明专利技术能够极大的提高CAR-T细胞的安全性，具有潜在的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因治疗领域。更具体地说，本专利技术涉及一种基于双链微载体将CAR基因定点整合至T细胞AAVSl位点的方法。
技术介绍
嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)T细胞疗法属于癌症免疫疗法的范畴，其主要策略是通过基因工程在T细胞上表达一种人工改造过的受体，该受体包含了可识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体单链可变区域(single-chain variable fragments ,scFV)和胞内信号域(参见Porter D L,Levine B L1Kalos M,et al.Chimeric antigenreceptor-modified T cells in chroniclymphoid leukemia.New England Journalof Medicine,2011,365(8):725-733.和Krug C1Wiesinger M1Abken H，et al.A GMP-compliant protocol to expand and transfect cancer patient T cells with mRNAencoding a tumor-specific chimeric antigen receptor.Cancer Immunology,Immunotherapy，2014:1-10和Sadelain MjBrentjens R, Riviere 1.The basicprinciples of chimeric antigen receptor design.Cancer discovery，2013，3(4):388-398.)。携带CAR的T细胞可直接识别目的抗原，而不在乎抗原是否递呈在MHC上，从而避免了 “MHC限制性”。在体内受到目的抗原刺激时可诱发一系列细胞免疫反应，最终杀灭靶细胞。理论上，通过改变受体的识别特异性，CAR-T细胞能够靶向任意一种肿瘤细胞，具有广阔的应用前景(Grada Z,Hegde MjByrd T，et al.TanCAR:a novel bispecific chimericantigen receptor for cancer immunotherapy.Molecular Therapy—NucleicAcids，2013，2(7):el05.和Bejcek B E,Wang D,Berven E，et al.Development andcharacterizat1n of three recombinant single chain antibody fragments(scFvs)directed against the CD19antigen.Cancer research，1995，55(II):2346-2351.和Eshhar Z,Waks T,Gross G，et al.Specific activat1n and targeting of cytotoxiclymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-bindingdomains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T—cellreceptors.Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences，1993，90(2):720-724.)。目前较为成熟的治疗策略包括，体外分离病人的T细胞，用慢病毒或逆转录病毒作为载体将编码CAR的基因整合到T细胞中，筛选稳定转染的细胞扩增后回输到病人体内。但慢病毒和逆转录病毒载体的基因整合形式为随机插入，在临床应用中存在免疫反应和基因突变的风险(Lipowska-Bhal la GjGi Iham D E , Hawkins R E，et al.Targetedimmunotherapy of cancer withCAR Tcells!achievements and challenges.CancerImmunology，Immunotherapy，2012，61(7):953-962.和June C HjBlazar B RjRiley JL.Engineering lymphocyte subsets: tools , trials and tribulat1ns.NatureReviews Immunology,2009,9(10):704-716.和Bendle G M,Haanen JBA G,SchumacherT N M.Preclinical development of T cell receptorgene therapy.Currentopin1n in immunology，2009,21(2): 209-214.)。为了克服这一风险，我们需要将 CAR 基因特异性的整合到基因组中的已知安全区域，这样才能保证外源基因的长期安全表达。AAV-1TR微载体是一种基于腺相关病毒基因组的线性闭环双链载体，它的结构简单，5’端和3’端分别为AAV2的倒置末端重复序列(ITR)，包围着中间的外源基因开放阅读框，研究者将其称为“CELiD” (closed-ended, linear duplex DNA)。不同于传统的细菌质粒载体，微载体删除了质粒复制序列，抗性基因等绝大部分细菌DNA，只保留基因表达所必需的顺式作用元件(参见Li L1Dimitriadis E K , Yang Y , et al.Product1n andCharacterizat1n of Novel Recombinant Adeno-Associated Virus Replicative-FormGenomes: A Eukaryotic Source of DNA for Gene Transfer.PloS one ,2013,8(8):e69879.)。其次，微载体是在真核细胞Sf9中生产，避免了内毒素污染的问题。AAV-1TR微载体的优点包括:低免疫源性;分子量小，易于转染;能够抵抗核酸外切酶的降解，基因表达持久稳定。重要的是，在AAV-Rep蛋白帮助下能够定点整合到19号染色体AAVSl位点(参见Zhang C,Cortez N G,Berns K 1.Characterizat1n of a bipartite recombinantadeno-associatedviral vector for site-specific integrat1n.Human genetherapy，2007，18(9): 787-797.) ^AVSl位点已被证明是安全可靠的位点，整合到这一位点的基因能够长期稳定的表达，而且至今没有发现致病性。若能利用CELiD载体携带CAR基因，同时构建一个质粒pCMV-Rep来提供整合所需的Rep78和Rep68蛋白，将这两个载体共转染T细胞，从而实现CAR基因在T细胞内的定点整合，则相关技术将极大的增强CAR-T疗法的安全性。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于双链微载体将CAR基因定点整合至T细胞AAVS1位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)针对某一特异性肿瘤抗原，利用基因文库和PCR技术设计合成CAR基因；2)将步骤1)合成得到的所述CAR基因插入杆状病毒包装质粒pFastBacDual‑ITR‑NeoR中，构建得到质粒pFastBacDual‑ITR‑CAR‑NeoR；3)将步骤2)得到的质粒pFastBacDual‑ITR‑CAR‑NeoR利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统，在昆虫细胞Sf9中制备携带有CAR和NeoR的双链微载体CELiDCAR载体；4)使用所述CELiDCAR载体和pCMV‑Rep质粒共同电转染体外培养的人T细胞，将CAR基因定点整合到所述T细胞的19号染色体AAVS1位点；5)利用G418培养基体外药物筛选和扩增步骤4)中成功稳定转染CAR基因的T细胞，并对所述成功转染CAR基因的T细胞进行基因整合位点的鉴定、CAR受体表达鉴定以及CAR受体免疫激活功能鉴定；其中，所述pCMV‑Rep质粒的构建步骤为：使用PCR扩增AAV‑Rep，经Xba Ⅰ和BgI Ⅱ消化后连入质粒pCMV‑MCS，得到pCMV‑Rep。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张春，张云，刘晓玫，张轶岭，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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