一种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种动物细胞大规模、高密度、微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法。其特点是利用摇动式反应器，微载体悬浮于反应器中，并处于不间断的流动状态，采用连续灌注的方式，不断补充营养物质并排出代谢废物，同时收获重组蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药工艺领域。具体涉及一种利用微载体技术灌注培养动物细胞生产蛋白的方法。
技术介绍
重组蛋白质类药物作为治疗性药物越来越凸显其重要的医用价值和商业价值。一般情况下，较大的、结构较复杂的蛋白质都是采用哺乳动物细胞表达系统来进行生产的。因此，重组蛋白质类药物的高水平生产依赖于哺乳动物细胞的培养工艺的选择与优化。目前，动物细胞培养工艺繁多，归纳起来有三大类，即贴壁培养、悬浮培养和固定化培养。贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行单层培养。由于细胞固定于表面，不需要复杂的细胞截流装置，便于采用灌注培养。然而与悬浮培养相比，贴壁培养扩大培养比较困难，不能有效监测。悬浮培养是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要由于非贴壁依赖性细胞培养，由于动物细胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感，因此保护细胞免受剪切力伤害是放大培养中一个重要问题。固定化培养是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养的一种方法。可以说，不同的培养工艺各有其特点。细胞微载体贴附悬浮培养，是贴壁培养技术的一种。其原理是将对细胞无害的微载体颗粒加入到反应器内的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。微载体贴附悬浮培养兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，容易放大，是公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，尤其适合工业上有重要价值的贴壁依赖型细胞系，如BHK、CHO等细胞。然而，利用生物反应器系统进行微载体大规模细胞培养，存在诸多影响因素和限制。其主要限制因素包括细胞对剪切力的敏感性、氧的传递效率以及传代和扩大培养等。无论是悬浮培养还是贴壁培养，就操作方式而言，可以分为:分批培养(Batch)、连续培养(Continuous)、灌注培养(Perfusion)、以及流加培养(Fed-batch)等，不同操作方式有其不同的特点。分批培养(Batch)，一次补料一次收获，操作简便，由于营养成分缺乏和代谢废物的积累，培养时间较短。流加培养(Fed-batch)，连续补料一次收获，适时补充营养成分，但是代谢废物积累过多。灌注培养(Perfusion)是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。其优点是可降低代谢废物，细胞密度较高从而较大提高产品的产量。针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本专利技术的目的在于，充分利用摇动式反应器传质、传氧效率高、营养物质混合均匀等优点，在此反应器中添加一定量微载体，为贴壁细胞生长提供表面积和微环境，并根据动物细胞生长代谢的特点，采用了优化的灌注培养方式，实现了贴壁细胞的高密度，长时间培养的，从而提高重组蛋白产量。
技术实现思路
为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案实现:该种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法，主要包括细胞的接种，起始生长阶段，改变培养条件，后续生长阶段，并在整个周期监测培养条件，即细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控分析主要过程。具体步骤如下: 1、细胞的接种。接种的动物细胞应是含有编码重组蛋白质基因及遗传控制元件的载体重组宿主细胞，并且是经过使用常规蛋白质检测方法检测，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹(Dot blot)、高效液相色谱(HPLC)、亲和层析等，并确定具有高效表达的重组宿主细胞。在此所说的哺乳动物细胞包括杂交瘤细胞、重组CHO细胞等半贴壁、贴壁依赖性工程细胞。表达目的重组蛋白质的宿主细胞得到鉴定后，通过多种方法增殖细胞。复苏的细胞在有限传代次数下，一般经过容积递增的容器逐级扩增，可以使细胞扩增至任何所需细胞密度，再接种至下一中间反应器或者最终生产反应器，接种前细胞应处于一定活率范围之内。并且扩增过程中可辅以使用额外装置、培养物中添加额外化学物质等手段调控某些条件，包括但不局限于pH、温度、溶解氧等，创造利于细胞增殖的环境。生产用生物反应器的起始细胞接种密度可根据实际情况选定，起始细胞密度可以为约每毫升4X 104个至每毫升5X 107个活细胞，甚至更高。接种的细胞也可以稀释至所需的密度以接种于生产用生物反应器，稀释所用溶液可以为与生产所用 的相同培养基，也可以为其他培养基。接种的细胞可以通过低速离心等方法将细胞从上清液中分离出来，或者接种的细胞连同之使用的培养基一并接入至最终生产用反应器。此接入方法也可以用于将复苏的细胞经过容积递增逐级扩增至中间反应器。最终生产用反应器为摇动式反应器，如激流式细胞生物反应器，也可以是其他由外在机械带动引起反应器内细胞培养物流动的反应器，其混合方式为摇动式混合，微载体悬浮存在于反应器中，并处于不间断的流动状态，细胞可长时间、高密度生长于微载体表面，并可持续收获重组蛋白。反应器内部的微载体为大孔的纸片式微载体，其材质是一次性聚酯纤维纸片或其它可具有相同功能的材质，其为大小0.5-3.5cm2，形状呈“V”或“W”型折叠，优化的大小及密度利于悬浮，微载体的数量与反应器工作体积的关系为:重量(克)/反应器工作体积(升)=10-20/1。接种的细胞处于均匀的单细胞悬液状态。接入最终生产用反应器时，早期应该处于静止培养，或者低速温和的搅拌，或者间断地搅拌，同时使微载体和细胞处于小的体积培养，搅拌速度38-41rpm/分钟或者根据反应器的体积大小逐渐提升。不论采用何种方式，时间为6-24小时。细胞接种时的体积，可以开始时低于最终工作体积，例如约三分之一终体积，待细胞粘附于微载体上，立即或几天逐渐扩大培养体积至最终工作体积。2、有血清培养液起始生长阶段。如上所述，细胞接入生产用反应器后，一旦已经迁移入微载体内部，或者已贴附在载体表面之上，细胞将在有利于存活和生长的条件下进入起始生长阶段。具体的条件将取决于细胞的类型、接种的细胞数量，表达重组蛋白质的性质和特征，以及生产反应器的工作体积和微载体的数量。根据本专利技术，生产生物反应器可以是激流式细胞生物反应器，也可以是其他由外在机械带动引起反应器内细胞培养物流动的反应器。细胞的起始生长开始阶段，其培养体积可以是最终工作体积的几分之一，也可以是最终工作体积，如果培养体积从开始未达到最终工作体积，可以根据实际情况另补入培养基。起始生长阶段的搅拌速度的选择，原则上应当使微载体处于悬浮状态，在通过间隔搅拌或者静止粘附时期之后，应当连续搅拌，搅拌速度为38-56转/分钟。根据细胞密度，微载体沉降，及随之引起的气体交换、营养物质交换的要求，搅拌速度可以是恒定的或者变化的，通常是增加的。起始生长阶段细胞培养物温度的选择，主要基于细胞可保持存活、生长和微载体贴附的温度范围内。一般而言，细胞保持在37°C生长良好，但是也能够根据细胞的需求和生产要求，选择细胞生长的合适温度。在一些优选方案中，起始生长阶段的培养温度维持在单一、恒定的温度。在另一些方案中，起始生长阶段的培养温度维持在一系列温度范围内，在多个时间点不连续的提高或者降低温度。起始生长阶段的其他培养条件，如pH、溶解氧等等，是已知对该细胞最佳的，一般的pH为6.9-7.4、溶解氧为30%-80%，培养时间是3_10天。3、改变培养条件 适合细胞培养物最初生长的条件，不一定适合细胞对重组蛋白质的表达。根据本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法，其特征在于，此生产方法用于细胞培养的反应器，其混合方式为摇动式混合，微载体悬浮存在于反应器中，并处于不间断的流动状态，细胞可长时间、高密度生长于微载体表面，并可持续收获重组蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆勇，张秀芹，张雪亭，刘铁成，王延涛，李会成，吕中华，王莹，李郑武，黄宇红，王丽娜，
申请(专利权)人：哈药集团技术中心，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23