本发明专利技术涉及一种获得神经白细胞素的方法。本发明专利技术人通过将支持细胞与神经干细胞共培养的方法发现这种培养促进了分化后神经元轴突的生长以及提高了神经元的存活率，并且发现支持细胞分泌神经白细胞素与这种对神经元生长与存活的促进具有关联。因此，可应用支持细胞来产生神经白细胞素，以及应用支持细胞来促进神经元生长与存活。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属动物细胞培养领域，涉及细胞分泌的新生化物质的发现、检测及鉴定的方法。
技术介绍
睾丸支持细胞(Sertoli cell, SCs)是由意大利人Enricol Sertoli于1865年在油镜下首次发现，并以其名字命名。Sertoli认为支持细胞是围绕着生精细胞生长的上皮细胞，而这些上皮细胞具有保护生精细胞的功能(Griswold M.D, Morales C, SylvesterS.R.Molecular biology of the Sertoli cell[J].0xford Reviews of ReproductiveBiology,1988，10:124-161)。Sertoli还建立了支持细胞的染色方法，即通过用硝酸和乙酸甚至碘液进行组织显色观察，获得了较清晰的细胞核结构。在Sertoli发现了支持细胞后，学者们展开了大量关于支持细胞的研究。在电子显微镜问世以前，SCs —直被认为是生精细胞的支架结构，并作用于生精发生的各个阶段从而促进精子细胞的生成。近年来，研究表明了 SCs不仅为生精细胞提供合适的生理发育的微环境，还能提供促进细胞生长和保护细胞免受免疫系统攻击的活性物质和信号分子。至今，SCs的功能与调控作用还不完全清楚。神经干细胞(Neural stem cell, NSCs)能在体外合适的生长环境中增殖形成神经球，同时保持高度未分化 的特性。1992年Reynolds等首次从成年鼠脑纹状体中分离出神经干细胞，并成功进行体外培养。体外扩增的神经干细胞克隆具有多分化潜能，并可以被诱导分化形成神经元(neuron),星形胶质细胞(astrocyte)及少突胶质细胞(oligodendrocyte)。神经干细胞体外分化的技术为治疗中枢神经系统损伤、神经系统病变及神经退行性疾病的治疗带来希望。根据文献报道，诱导神经干细胞分化主要通过以下三个方面进行:(I)将携带治疗作用的目的基因的神经干细胞进行移植；(2)在神经干细胞的生长环境中添加特殊的细胞因子进行诱导；(3)通过与滋养细胞共培养定向分化至功能神经元细胞。神经干细胞向神经元等神经终末端细胞的分化受控于基因的调节，即神经干细胞向不同功能的神经细胞定向分化时需要不同的基因进行调控。NSCs 一直被利用来进行外源移植治疗神经退行性疾病(NeurodegenerativeDiseases)，但是直接移植胚胎NSCs会有产生畸胎瘤的风险。为保证移植安全，NSCs常在体外被诱导形成分化终末端的神经细胞以后再进行移植。SCs能够提供多种神经营养因子和信号分子，在和NSCs共移植能促进发育和干细胞向神经元分化。同时，SCs还能为共移植物提供局部免疫豁免效应从而提闻了移植的效率。但是，目前现有技术中关于支持细胞是否能够促进神经元存活和轴突生长等方面还鲜有报道，也不清楚这种促进作用是由哪些活性物质所致。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种产生神经白细胞素(NLK)的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种促进神经元轴突生长的方法、本专利技术的另一目的还在于提供神经白细胞素的一种新用途。在本专利技术的第一方面，提供一种产生神经白细胞素(NLK)的方法，所述方法包括:培养睾丸支持细胞，从而分泌产生神经白细胞素。 在一个优选例中，所述方法包括:(I)采用含10±1% (v/v)血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基培养睾丸支持细胞；(2)细胞贴壁(较佳地，70%以上细胞贴壁；更佳地，75%以上细胞贴壁；更佳地，80%或80%以上细胞贴壁)后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基，加入无血清DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基，继续培养；和(3)步骤(2)获得的细胞培养物取上清悬浊液，其中含有神经白细胞素。在另一优选例中，所述的血清是胎牛血清。在另一优选例中，步骤(2)中，无血清DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基中，细胞培养2-10天；较佳地2-8天；更佳地2.5-6天，如5天、4天、3天。在另一优选例中，步骤⑴中，培养基中睾丸支持细胞的密度是IX IO4 IXlO6细胞/ml。在另一优选例中，步骤(I)中，培养基中睾丸支持细胞的密度是2X IO4 8X IO5细胞/ml ;更佳地为4X IO4 6X IO5细胞/ml。 在另一优选例中，所述的方法还包括:从睾丸支持细胞培养物中分离分泌产生神经白细胞素。在本专利技术的另一方面，提供一种促进神经元轴突生长的方法，所述方法包括:(a)培养睾丸支持细胞(作为饲养(层)细胞)，其分泌产生神经白细胞素；(b)在(a)的细胞培养体系中加入神经干细胞；使神经干细胞与睾丸支持细胞混合，或使神经干细胞与睾丸支持细胞不混合但发生胞间物质交换；从而神经干细胞分化为神经元，所述的神经元轴突生长能力增强且轴突上突触数目增加。在另一优选例中，步骤(a)包括:采用含10 ± I (v/v) %血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基培养睾丸支持细胞；细胞贴壁(较佳地，70%以上细胞贴壁；更佳地，80%以上细胞贴壁；更佳地，90%以上细胞贴壁)后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基。在另一优选例中，步骤(a)中，睾丸支持细胞的密度是IXlO4 IX IO6细胞/ml (较佳地2X IO4 8X IO5细胞/ml ;更佳地为4X IO4 6X IO5细胞/ml);和/或步骤(b)中，神经干细胞的密度是IX IO4 IX IO6细胞/ml (较佳地2X IO4 8 X IO5细胞/ml ;更佳地为4 X IO4 6 X IO5细胞/ml)。在另一优选例中，步骤(b)中，通过渗透膜隔离神经干细胞与睾丸支持细胞，使神经干细胞与睾丸支持细胞不混合但发生胞间物质交换。在另一优选例中，所述的渗透膜是孔径为0.m的膜。在另一优选例中，所述的方法的步骤(b)之后还包括:分离所述的神经干细胞。在另一优选例中，步骤(b)中，加入神经干细胞后继续培养2-10天(较佳地4-10天；更佳地5-9天，如6天、7天、8天)。在本专利技术的另一方面，提供一种神经白细胞素的用途，用于制备促进神经元轴突生长的组合物。在另一优选例中，所述组合物还用于增加神经元上突触数目。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、睾丸支持细胞鉴定。A:HE染色鉴定；B =DAPI荧光染色鉴定；C:扫描电子显微镜下10000倍放大效果图。图2A、神经干细胞聚集体的形成。图2B、荧光显微镜下观察在第72h时形成的神经球。图3、神经干细胞及其分化后神经元与星形胶质细胞的鉴定图。A图为分离培养第3代后NESTIN阳性单细胞；B图为DAPI细胞核荧染；C图为A，B的合成图；D图为神经干细胞分化成的神经元(标记beta TujIII) ;E图由神经干细胞分化而成的星形胶质细胞(标记GFAP) ；F图为神经干细胞接种后培养第3天时形成的神经球的NESTIN荧光照片(比例尺:30 u m) o图4、神经干细胞培养至第一、三、五天时的形态变化(比例尺:30 U m)。A、B:第一天时为单细胞形态；C:第三天时的神经球；D:第五天时的神经球。图5、在不同接种密度条件下神经干细胞的生长变化曲线。图6、通过免疫荧光染色本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产生神经白细胞素的方法，其特征在于，所述方法包括：培养睾丸支持细胞，从而分泌产生神经白细胞素。
【技术特征摘要】
1.种产生神经白细胞素的方法，其特征在于，所述方法包括:培养睾丸支持细胞，从而分泌产生神经白细胞素。2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)采用含10±1%(v/v)血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基培养睾丸支持细胞； (2)细胞贴壁后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基，加入无血清DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基，继续培养；和 (3)步骤(2)获得的细胞培养物取上清悬浊液，其中含有神经白细胞素。3.权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，无血清DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基中，细胞培养2-10天。4.权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，培养基中睾丸支持细胞的密度是 I X IO4 I X IO6 细胞 /ml。5.种促进神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述方法包括: (a)培养睾丸支持细胞，其分泌产生神经白细胞素； (b)在(a)的细胞培养体系中加入神...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭美锦，邓磊，张嗣良，储炬，庄英萍，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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