本发明专利技术公开了一种绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液，按照以下方法制备：A1去菌发酵滤液的制备：A2采用硫酸铵沉淀法提取抗菌物质，制备活性粗蛋白；利用55%饱和度的硫酸铵盐析浓度对发酵液进行粗提取，得到的即为活性粗蛋白；A3?纯化抗菌蛋白，得到几丁质结合抗菌蛋白母液；在杂交竹栽培区，发病前喷雾或灌（根）10-50倍（体积比）上述抗菌蛋白，喷雾每株200毫升，防治效果为70-80%；灌根每株100毫升，防治效果为75-85%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制备诱导杂交竹抗病药剂中的应用。
技术介绍
撑X绿杂交竹是南方重要的经济用材竹，也是四川等地引种发展的主要经济竹种之一。近年来，由丝孢纲真菌暗孢节菱孢菌[Arthrinium phaeospermum (Corda)M.B.Ellis]引起的杂交竹梢枯病导致撑X绿杂交竹大面积枯死，造成巨大的经济损失，极大地威胁着长江中上游地区退耕还林的进程和生态屏障的建设。目前主要采用化学防治和营林技术，而生物防治措施研究较少。化学防治虽是一种有效的防治手段，但存在病原菌抗药性、环境与食品安全、药害等许多实际问题，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已严格限制使用。而与环境友好的生物农药越来越受到人们的青睐，是未来农业可持续发展的重要组成部分。李姝江和憔天敏等从杂交竹健康植株分离到一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugin osa) ZB27,用其菌悬液和代谢产物处理对杂交竹梢枯病有较好的防治效果，但铜绿假单胞菌为条件致病菌，作为生防菌剂在田间使用受到限制，而本专利技术涉及的绛红褐链霉菌SP3(本申请人已于2012年09月27日申请中国专利，申请号为201210367119.3，公开号CN102864110A，专利技术名称:绛红褐链霉菌SP3菌株及其在红豆杉土传根病和红豆杉促生上的应用)对杂交竹生防效果较好，但用其代谢产物一纯抗菌蛋白作为诱导因子，诱导植物抗性，提高杂交竹免疫性尚无人报道。诱导抗性，即利用生物或非生物因子激发植物的防卫基因，使植物产生局部的或系统的抗病性而达到防病的效果，在植物病害防治中具有重要的意义。其中，关于化学诱导因子诱导抗性的研究国内外报道很多。另外，利用生物因子诱导植物产生抗性的研究也较多，这些生物因子包括致病菌、弱毒小种、AM真菌、植物根围促生细菌(PGPR)和放线菌等。随着研究的深入，发现一些来源于微生物的诱导因子和微生物一样可以诱导寄主植物产生防卫反应，尤其是诱导植保素的合成和积累。Thakkera等利用从Fusarium oxysporum f.sp cubense获得的激发子处理香蕉根部，可引起香蕉叶片防御性相关酶的积累，能有效提高感病品种的抗性Jung等发现从芽孢杆菌菌株中纯化获得的细菌素(class lid)可诱导大豆PAL、APX> SOD和PPO等活性的增加；Mao等从Alternaria tenuissima的菌丝中纯化得到耐热酸性蛋白激发子PeaTl，能够诱导烟草对TMV产生系统抗病性；李云锋等利用从稻瘟病菌细胞壁中纯化获得的糖蛋白激发子CSB I (分子量为102 kDa)接种水稻，可引起叶片内P0D、PAL、L0X活性、绿原酸和木质素含量的显著增加。蒋继志等从31种微生物中筛选出了两种放线菌源激发子，其中放线菌A 5295发酵液型激发子诱抗效果最高，达63.97%，并推测发酵液中有效诱抗物质可能是蛋白质类、多糖类等物质
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制备诱导杂交竹抗病药剂中的应用。本专利技术涉及的绛红褐链霉菌SP3菌株，本申请人已于2012年09月27日申请中国专利，申请号为201210367119.3，公开号CN102864110A，专利技术名称:绛红褐链霉菌SP3菌株及其在红豆杉土传根病和红豆杉促生上的应用。本专利技术的技术方案如下:—种绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液,按照以下方法制备:Al去菌发酵滤液的制备:从新鲜培养的斜面菌种制备绛红褐链霉菌SP3孢子悬浮液，调整孢子浓度为108cfu/mL ;然后以1%的接种量接入灭菌的发酵培养基中，于25°C、140r/min振荡培养4d，发酵液于8000r/min离心15min,取上清液用0.45 μ m孔径的微孔滤膜过滤除菌,备用；A2采用硫酸铵沉淀法提取抗菌物质，制备活性粗蛋白；利用55%饱和度的硫酸铵盐析浓度对发酵液进行粗提取，得到的即为活性粗蛋白；A3纯化抗菌蛋白，得到几丁质结合抗菌蛋白母液:A31 DE52离子交换层析；A32 Sephadex G-75 凝胶过滤层析；A33 Sephadex G-50 凝胶过滤层析； 所述的绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液在制备诱导杂交竹抗病药剂中的应用，在杂交竹栽培区，发病前喷雾或灌根10-50倍(体积比)所述绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液，喷雾每株200晕升；灌根每株100晕升。不论是喷雾或是浸根诱导，不同浓度抗菌蛋白处理的病情指数差异显著，除200倍稀释液处理与对照差异不显著外，其余均显著低于对照(P < 0.05)，其中以10倍稀释液处理的病情指数最低，分别是23.95和20.89，20倍稀释液次之。喷雾和浸根两种诱导方法都以10倍抗菌蛋白稀释液的诱抗效果最好，分别为56.22%和62.88% ;其次是50倍稀释液的处理，分别为45.39%和51.18% ;再者，100倍稀释液的诱抗效均在20%以上；200倍稀释液诱导后挑战接种发病最为严重，诱抗效果仅为0.10%和-2.77%。表明随着抗菌蛋白处理浓度的升高，杂交竹的抗病能力也随之增强。附图说明图1为粗蛋白经DE52离子交换层析结果；图2为峰5经Sephadex G-75凝胶过滤层析结果；图3为峰5-4反向HPLC纯度检测结果；图4为峰5-4经Sephadex G-50凝胶过滤层析结果。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施例1绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白(几丁质结合抗菌蛋白母液)制备本专利技术涉及的绛红褐链霉菌SP3菌株，本申请人已于2012年09月27日申请中国专利，申请号为201210367119.3，公开号CN102864110A，专利技术名称:绛红褐链霉菌SP3菌株及其在红豆杉土传根病和红豆杉促生上的应用。1.去菌发酵滤液的制作从新鲜培养的斜面菌种制备绛红褐链霉菌SP3孢子悬浮液，调整孢子浓度为108cfu/mL;然后以1%的接种量接入灭菌的发酵培养基(黄豆饼粉3g，葡萄糖5g，甘油5g，蛋白胨 5g，NaCl 2.5g, CaCO2 2g，蒸馏水 IOOOmL)中，于 25°C、140r/min 振荡培养 4d，发酵液于8000r/min离心15min,取上清液用0.45 μ m孔径的微孔滤膜过滤除菌,备用。2抗菌物质提取方法筛选(I)甲醇、乙醇和丙酮提取取3份去菌发酵滤液，每份IOOmL,按照1:5 (v/v)的比例分别加入冷甲醇、乙醇和丙酮(_2(TC ),在_2(TC放置IOmin, 10 000r/min离心15min,使沉淀风干,上清液用旋转蒸发仪减压蒸干，沉淀物和蒸干 物分别用0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl缓冲液溶解并调整至5mL,测定其抑菌活性(采用杯碟法测定待测物质的抑菌活性。在PDA平板中央接入直径6mm供试真菌菌丝块，用打孔器距中心3.0cm处无菌挖取4个孔洞。每孔加入100 μ L待测物质，于25°C培养3-5d测量抑菌带宽度，下文粗蛋白及抗菌蛋白活性测定均以杂交竹梢枯病菌为指示菌。以加灭菌后的Tris-HCl做对照，每处理均设3个重复。( 2 )硫酸铵沉淀法提取取去菌发酵滤液IOOmL,在0°C下加入硫酸铵使溶液相对本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液，其特征在于，按照以下方法制备：A1去菌发酵滤液的制备：从新鲜培养的斜面菌种制备绛红褐链霉菌SP3孢子悬浮液，调整孢子浓度为108cfu/mL；然后以1%的接种量接入灭菌的发酵培养基中，于25℃、140r/min振荡培养4d，发酵液于8000r/min离心15min，取上清液用0.45μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，备用；A2采用硫酸铵沉淀法提取抗菌物质，制备活性粗蛋白；利用55%饱和度的硫酸铵盐析浓度对发酵液进行粗提取，得到的即为活性粗蛋白；A3?纯化抗菌蛋白，得到几丁质结合抗菌蛋白母液：A31??DE52离子交换层析；A32?Sephadex?G?75凝胶过滤层析；?A33?Sephadex?G?50凝胶过滤层析。
【技术特征摘要】
1.一种绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液，其特征在于，按照以下方法制备: Al去菌发酵滤液的制备: 从新鲜培养的斜面菌种制备绛红褐链霉菌SP3孢子悬浮液，调整孢子浓度为IO8Cfu/mL ;然后以1%的接种量接入灭菌的发酵培养基中，于25°C、140r/min振荡培养4d，发酵液于8000r/min离心15min,取上清液用0.45 μ m孔径的微孔滤膜过滤除菌,备用； A2采用硫酸铵沉淀法提取抗菌物质，制备活性粗蛋白；利用55%饱和度的硫酸铵盐析浓度对...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱天辉，张丽娜，李姝江，韩珊，谯天敏，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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