通过在获自细胞培养物的液体中改变PH灭活蛋白酶的方法技术

本发明专利技术涉及通过在纯化生物药物的方法开始时，重复地改变细胞培养物上清液的pH而灭活蛋白酶的方法。将所述pH首先调节至3-5，然后调节至7-9。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于制造生物制药产品的领域。其具体涉及通过在不含细胞的细胞培养物上清液中灭活蛋白水解活性酶来改进制备生物制药产品的方法。背景生物分子(例如蛋白、多核苷酸、多糖等)不断获得商业重要性，以用作药物、诊断试剂、食品添加剂、洗涤剂等，用作研究试剂和用于许多其他应用。对所述生物分子(例如蛋白)的需求一般不再通过从天然来源分离分子而得以满足，而是需要使用生物技术生产方法。经生物技术制备蛋白通常由克隆DNA片段至合适的表达载体中开始。转染所述表达载体至合适的原核或真核表达细胞及随后选择受感染的细胞后，将受感染的细胞在发酵罐中培养，并表达所需蛋白。然后采集细胞或培养物上清液，并将其中所含的蛋白进行后处理和纯化。 众所周知，蛋白酶存在于采集的液体中，例如在不含细胞的培养物上清液中。生物药物(例如单克隆抗体或重组蛋白)以及色谱材料(例如固定的蛋白A)均被蛋白酶迅速降解或破坏结构。这导致损害产物品质(同质性、功能性)，而且在色谱材料中降低结合容量，导致污染结合的产物级分。尤其在不含血清的培养和高产量细胞中，制备的生物药物以高相对浓度存在，因此尤其易于被蛋白水解性损坏其分子结构，导致同时产率降低和产物品质降低。蛋白酶导致的蛋白损坏甚至可以在中性pH发生，但是尤其当不含细胞的培养物上清液必须调节至酸性PH水平以用于纯化方法时(例如，为了为捕获步骤(例如阳离子交换色谱(预处理))创造所需的结合条件)，可以观察到广泛的蛋白降解。众所周知，通过改变pH水平不可逆地灭活了一些蛋白酶(例如消化酶，例如胃蛋白酶)(Z. Bohak, Purification and Characterization of Chicken Pepsinogenand Chicken Pepsin, Journal of Biological Chemistry244(17)(1969)4633 - 4648;B.Turk, V. Turk, Lysosomes as Suicide Bags in Cell Death:Myth or Reality , Journalof Biological Chemistry284 (33) (2009) 21783 - 21787) 0 已经提议加入蛋白酶抑制剂(A. J. Barrett, A. A. Kembhavij M. A. Brown, H. Kirschkej C. G. Knight, M. Tamai and K. Hanada，L-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido(4-guanidino)butane(E-64) and its analoguesas inhibitors of cysteine proteinases including cathepsins Bj H and Lj Biochem.J. 201 (1982) 189 - 198)。然而，这些蛋白酶抑制剂非常昂贵、具有毒性且难以从产物中去除。因此，蛋白酶抑制剂不是经济地生产安全药物的选择。专利技术概述本专利技术涉及通过在纯化生物药物的方法开始时，重复地改变细胞培养物上清液的pH而灭活蛋白酶的方法。本专利技术的优点在于提高产物品质和产物产率，以及延长色谱材料的寿命。令人奇地，已经发现采集的哺乳动物细胞系(例如CH0，〃中国仓鼠卵巢〃细胞)的不含细胞的发酵上清液中含有以下蛋白酶其可以通过改变至酸性pH而活化，也可以在最适pH通过随后改变pH至中性范围而不可逆地灭活其活性。在中性pH水平具有活性的蛋白酶也可以在中性条件下通过改变至酸性PH水平而不可逆地灭活其活性。本专利技术具体涉及在获自细胞培养物的液体中灭活蛋白酶的方法，包括以下步骤(a)调节所述液体的pH至3-5，然后(b)调节所述液体的pH至7-9。附图说明图1 :通过两次改变pH活化和灭活来自CCF的蛋白酶。图2:在酸性pH降解模型底物干扰素(IFN)。将O. lmg/ml干扰素在37 ° C与10%(v/v)细胞培养物上清液(CCF) —起在pH4培养O或14小时，伴随和不伴随pH改变(泳道2至4)，并通过SDS-PAGE分离。在20。C进行pH改变，且在pH4和pH7暂停5分钟。与没有PH灭活相比，通过改变pH (泳道3)使得IFN的降解显著减少。14小时后，IFN已经完全分解(泳道4)。泳道的布置: 1-标记2 -1FN (O. lmg/mL)，培养前3 - CCF+IFN pH4,伴随改变pH，培养14小时4 - CCF+IFN pH4,不伴随改变pH，培养14小时图3 :通过与CCF、10%(v/v)在pH4. O培养3小时降解蛋白IFN，用RP-HPLC分析。通过中和灭活蛋白酶及随后与IFN在pH4. O培养后，3小时后，仍可通过RP-HPLC检测到72%的IFN，与此同时，没有灭活时，仅43%的IFN仍然完整。因此与野生型蛋白相比，蛋白水解活性减半。图4 :在酸性和中性pH的荧光测试。CCF中的蛋白酶在ρΗ3· 5 ( ·)和ρΗ7 ( ▲)具有活性。作为在ΡΗ3. 5和pH7，CCF中的蛋白酶产生的蛋白水解活性的量度，测量了通过裂解肽底物释放的荧光团。图5 :伴随和不伴随pH改变时中性蛋白酶的蛋白水解活性。通过酸化至pH〈5及随后中和，中性蛋白酶可能最完全地且不可逆地灭活。在各种情况下，所述测量在PH7进行，测量通过裂解肽底物释放的荧光团作为蛋白水解活性的量度。图6 :伴随和不伴随pH改变时酸性蛋白酶的蛋白水解活性。激活/灭活CCF中的蛋白酶类似于图1通过改变PH进行。活化的蛋白酶在pH〈5具有活性且裂解底物。在pH3. 7，活化的蛋白酶(其已经通过在PH > 7短暂培养灭活)展示的残留活性降低至35%。在各种情况下，所述测量在PH3. 7进行，测量通过裂解肽底物释放的荧光团作为蛋白水解活性的指标。专利技术详述本专利技术涉及灭活蛋白酶的方法，其通过在纯化方法开始时，重复地改变细胞培养物上清液的PH进行。本专利技术的优点在于提高产物品质和产率，以及延长色谱材料的寿命。令人奇地，发现采集的哺乳动物细胞系(例如CH0，〃中国仓鼠卵巢〃细胞)的不含细胞的发酵上清液中含有以下蛋白酶其可以通过改变至酸性PH而活化，也可以在最适pH通过随后改变pH至中性范围而不可逆地灭活其活性。在中性pH水平具有活性的蛋白酶也可以在中性条件下通过改变至酸性pH水平而不可逆地灭活其活性。在另一方面，本专利技术涉及在获自细胞培养物的液体中减少蛋白降解的方法，包括以下步骤(a)调节所述液体的pH至3-5，然后(b)调节所述液体的pH至7-9。酸化细胞培养物上清液后，明显地出现现有蛋白酶的活化，表明存在原来溶酶体的蛋白水解酶(组织蛋白酶)。这些蛋白酶参与降解内吞的蛋白，普遍地表达在所有组织中作为非-活化的形式，并且在细胞内位于核内体内。这些隔室成熟形成溶酶体伴随显著降低PH，其同时导致自催化和反式激活溶酶体的蛋白酶。在肿瘤组织转移的背景下简要讨论了组织蛋白酶分泌进入细胞外隙，并且已经公开了一些个别组织蛋白酶分泌入细胞培养物中。在中性pH值的蛋白水解活性可以一方面归因于分泌的蛋白酶，另一方面归因于原本位于膜中的蛋白酶，其推定在生产过程中 从细胞膜中分离出来并在溶液中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.20 EP 10173540.51.在获自细胞培养物的液体中灭活蛋白酶的方法，其包括以下步骤 (a)调节所述液体的pH至3-5，然后 (b)调节所述液体的pH至7-9。2.在获自细胞培养物的液体中减少蛋白降解的方法，其包括以下步骤 (c)调节所述液体的pH至3-5，然后 (d)调节所述液体的pH至7-9。3.权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(a)的pH的范围为3.5-4. 5。4.权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于步骤(a)的pH保持5分钟至30分钟...

【专利技术属性】
技术研发人员：A贾克比，D阿姆布罗西斯，P杜伯西恩，C厄科曼，F诺蒂尔弗，
申请(专利权)人：贝林格尔英格海姆国际有限公司，
类型：
国别省市：