本发明专利技术公开了一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养TIL细胞的方法。所述搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料，所述生物反应器含有其外包裹减小剪切力材料的搅拌桨，使用该生物反应器培养TIL细胞。本发明专利技术使用生物反应器培养TIL细胞，在搅拌桨外包裹可以减小剪切力的材料，可以降低细胞受到的剪切力伤害，有利于细胞大量扩增。本发明专利技术培养过程中不停的搅拌，为动态系统，有利于细胞进行气体交换和为细胞提供均一的培养环境，有利于细胞大量扩增。本发明专利技术方法不仅可以大量扩增TIL细胞，而且所得TIL细胞表面抗原表达量较高，对肿瘤细胞的杀伤活性较强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养TIL细胞的方法。
技术介绍
肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte,TIL细胞)是一群存在于肿瘤间质中的异质性淋巴细胞，TIL细胞对癌性胸、腹腔积液患者疗效显著。一般从肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中分离出的淋巴细胞经IL-2培养得到，其肿瘤杀伤活性为MHC限制性，即为自体肿瘤特异性杀伤细胞，具有CD3+CD8+或CD3+CD4+表面标志。经测试TIL细胞的抗肿瘤效果是LAK的50～100倍，TIL细胞回输到体内血液及肿瘤中可以存留达两个月之久，因此它有着巨大的潜在临床治疗价值。目前，TIL细胞治疗被广泛应用于临床治疗，并取得良好效果。很多实验室开展的TIL细胞培养大多数为小规模培养，把从癌性胸腹水离心得到的细胞用密度梯度离心法分离得到TIL细胞，用含10％FBS的RPMI1640培养基和IL-2接种到培养瓶中，通过添加IL-2促进TIL细胞在体外大量扩增，中分装到培养瓶中或者培养袋中扩增培养。现有TIL细胞的培养规模小，操作复杂，步骤繁琐，扩增倍数低，所扩增得到的数量不够用于临床治疗，而且培养密度不能过高，浪费培养基，不利于节约成本和培养空间。此外表面抗原表达量低，杀伤效果差。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养TIL细胞的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种使用生物反应器培养TIL细胞的方法，搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料。优选地，所述使用生物反应器培养TIL细胞的方法，包括以下步骤：用X-VIVO15培养基将PBMC按照1×106cells/ml的密度接种于培养瓶中，添加1％培养基体积的TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液，在37℃、5％CO2条件下培养，每2～3天补充适量的培养基和IL-2，当培养体系达到一定体积后，转入生物反应器中继续培养至两周；所述TNF-α溶液的浓度为50～500ng/ml，IL-2溶液的浓度为100～1000U/ml，OKT-3溶液的浓度为500～2000U/ml。优选地，所述TNF-α溶液的浓度为200ng/ml，IL-2溶液的浓度为300U/ml，OKT-3溶液的浓度为500U/ml。优选地，当培养体系大于500ml时，转入2L生物反应器中继续培养。优选地，在生物反应器中培养TIL细胞的条件为：溶氧量为50％，pH7.2，搅拌速度为45rpm。优选地，所述PBMC通过以下方法获得：外周血和生理盐水按体积比1:1进行稀释得到血液稀释液，将其加至二分之一倍体积的淋巴细胞分离液上方，升降速调为0，800g离心30min，取单个核细胞层，用RPMI1640培养基清洗两次，用X-VIVO-15培养基重悬细胞即得PBMC。一种生物反应器搅拌桨，所述搅拌桨外包裹减小剪切力的材料。一种生物反应器，所述生物反应器的搅拌桨外包裹减小剪切力的材料。优选地，所述减小剪切力的材料为医用硅胶管或食用橡胶管。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术使用生物反应器培养TIL细胞，在搅拌桨外包裹可以减小剪切力的材料，可以降低细胞受到的剪切力伤害，有利于细胞大量扩增。2、本专利技术使用生物反应器培养TIL细胞，在培养过程中不停的搅拌，为动态系统，有利于细胞进行气体交换和为细胞提供均一的培养环境，有利于细胞大量扩增。3、本专利技术使用生物反应器培养TIL细胞，在保证细胞质量的前提下，能够显著提高细胞培养密度，有利于节约培养基和培养空间。4、本专利技术使用生物反应器培养TIL细胞，更接近人体内三维生长环境，与使用培养瓶、培养袋等细胞贴壁生长的培养方式相比，更利于细胞大量扩增，可以大规模培养TIL细胞，而且所得TIL细胞表面抗原表达量较高，对肿瘤细胞的杀伤活性较强。附图说明图1为各实施例和对比例培养的TIL细胞对HepG2细胞的杀伤活性结果。具体实施方式为了更好的说明本专利技术，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。TIL细胞是PBMC在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。PBMC可以使用现有任何方法获得。本专利技术中PBMC通过以下方法制备：把60ml外周血转移至离心管中，用生理盐水按体积比1:1进行稀释，得到血液稀释液；在一新离心管中加入淋巴细胞分离液，把血液稀释液缓慢添加至淋巴细胞液层上方，形成明显的分界线，其中，淋巴细胞分离液与血液稀释液的体积比为1：2；升降速调为0，800g离心30min，离心结束后，用巴氏吸管小心抽取单个核细胞层至另一新离心管中，往该离心管中添加RPMI1640培养基清洗细胞，300g离心5min，弃上清，再次添加RPMI1640培养基清洗细胞，300g离心5min，弃上清；用X-VIVO-15培养基重悬细胞得到PBMC悬液。取20μlPBMC悬液用台盼蓝染色法(台盼蓝与PBMC悬液体积比为1:1)进行计数。实施例1自2L生物反应器(购自北京元唐盛兴科技有限公司，美国BELLCO)中取出搅拌桨，在搅拌桨外套上医用硅胶管，紫外照射灭菌后，重新将搅拌桨装回生物反应器内。使用该生物反应器培养TIL的方法如下：取2×107个PBMC，按照1×106cells/ml的密度用X-VIVO15培养基接种于T75培养瓶中，添加TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液培养，TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液的添加量为培养基体积的1％。根据细胞的扩增情况，进行分瓶培养，当培养体系总量大于500ml时，将其转入2L生物反应器中，按照温度37℃，CO2通气量为5％，溶氧量为50％，pH为7.2，搅拌速度为45rpm的条件继续培养至两周，培养基为含1～10U/mlIL-2、0.5～5ng/mlTNF-α和5～20U/mlOKT-3的X-VIVO15培养基。所述TNF-α溶液的浓度为50～500ng/ml，IL-2溶液的浓度为100～1000U/ml，OKT-3溶液的浓度为500～2000U/ml。本实施例中所述TNF-α溶液的浓度为200ng/ml，IL-2溶液的浓度为300U/ml，OKT-3溶液的浓度为500U/ml。整个培养过程中观察并记录细胞生长情况，每2～3天本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用生物反应器培养TIL细胞的方法，其特征在于，搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料。
【技术特征摘要】
1.一种使用生物反应器培养TIL细胞的方法，其特征在于，搅拌桨外包裹
有减小剪切力的材料。
2.根据权利要求1所述的使用生物反应器培养TIL细胞的方法，其特征在
于，包括以下步骤：
用X-VIVO15培养基将PBMC按照1×106cells/ml的密度接种于培养瓶中，
添加1％培养基体积的TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液，在37℃、5％CO2条件下培养，每2～3天补充适量的培养基和IL-2，当培养体系达到一定体积后，
转入生物反应器中继续培养至两周；
所述TNF-α溶液的浓度为50～500ng/ml，IL-2溶液的浓度为100～1000U/ml，
OKT-3溶液的浓度为500～2000U/ml。
3.根据权利要求1所述的使用生物反应器培养TIL细胞的方法，其特征在
于，所述减小剪切力的材料为医用硅胶管或食用橡胶管。
4.根据权利要求2所述的使用生物反应器培养TIL细胞的方法，其特征在
【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，陈海佳，葛啸虎，曾维杰，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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