一种具有抗菌功能的融合蛋白及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种具有抗菌功能的融合蛋白及其构建方法和应用，所述融合蛋白由经修饰的小鼠Reg3α抗菌蛋白和6个组氨酸组成，是含有SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的肽，其构建方法是将Reg3α与表达质粒pwPICZalpha连接构成重组表达质粒pwPICZalpha-Reg3α，线性化后整合到毕赤酵母基因组中，挑取阳性克隆诱导表达，进而以ProteinPureNi-NTA树脂和强阳离子交换树脂纯化得到。本发明专利技术构建的融合蛋白具有抗staphylococcus的能力，可用于生产动物饲养用抗菌蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种具有抗菌功能的融合蛋白及其构建方法和应用，所述融合蛋白由经修饰的小鼠Reg3α抗菌蛋白和6个组氨酸组成，是含有SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的肽，其构建方法是将Reg3α与表达质粒pwPICZalpha连接构成重组表达质粒pwPICZalpha-Reg3α，线性化后整合到毕赤酵母基因组中，挑取阳性克隆诱导表达，进而以ProteinPureNi-NTA树脂和强阳离子交换树脂纯化得到。本专利技术构建的融合蛋白具有抗staphylococcus的能力，可用于生产动物饲养用抗菌蛋白。【专利说明】一种具有抗菌功能的融合蛋白及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种融合蛋白，特别是涉及一种利用基因工程重组技术构建的Reg3 a 融合蛋白，以及该融合蛋白的构建方法和应用。
技术介绍
Reg3 a (Regenerating islet-derived protein 3 alpha)属于 C 型凝集素超家族，对革兰氏阳性耐药细菌具有显著的直接杀伤和抑制效果，其主要依赖C端结构域与细菌细胞壁肽聚糖的结合作用，以补体杀伤的模式对革兰氏阳性菌的细胞壁进行作用。在组织受损的状态下，Reg3 a的表达不仅能促进细胞的增殖，而且能防止伤口感染，有助于伤口愈合。另外，Reg3a对于急性炎症的发生具有一定的抑制作用，能缓解炎症因子的过度产生所造成的组织损伤。综上所述，Reg3a具有抑制病原微生物生长、促进细胞增殖以及抑制损伤部位炎症因子过表达的功能，有望成为治疗感染、炎症和组织受损的新型药物。毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统，它既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点， 如糖基化、蛋白磷酸化等，同时还避免了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷。除此之外，由于其在蛋白质表达方面还具有以下几个其它表达系统所不可比拟的优点，使得该系统成为目前研究最多、应用最广泛的真核表达系统之一:1)它所携带的aox启动子是一种强有力的启动子，受甲醇严格诱导调控而表达，所以可严格调控外源蛋白的表达；2)可以对表达蛋白进行糖基化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、脂类酰化等一系列的翻译后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性；3)表达量高，迄今为止，已有300多种异源蛋白在该表达系统中获得了高效表达，如破伤风毒素片段C可达12g/L，而明胶的表达量甚至达到了 14.8g/L ;4)外源基因的表达产物既可存在于胞内，又可通过其特有的信号肽a -因子或天然蛋白本身的信号肽分泌至细胞外，同时，该系统自身分泌的蛋白非常少，这大大简化了纯化过程；5)整合入外源基因的重组子表达系统十分稳定，有文献报道，通过同源重组整合入外源基因的重组子表达系统可连续培养50代，却未见外源基因丢失的现象；6)糖基化程度低，毕 赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8-14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50-150甘露糖残基要短得多，同时，由于毕赤酵母不能象酿酒酵母那样在核心多糖末端形成a -1, 3末端甘露糖，使得它的蛋白抗原性远远低于后者，因而更适合于治疗用途；7)该表达系统由于对营养要求低，培养基成份简单廉价，可进行高密度高产量的发酵培养，便于工业化生产。利用毕赤酵母构建的高效表达系统能够显著提高蛋白的产量，从而降低蛋白的生产成本，对蛋白的工业化生产具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有抗菌功能的融合蛋白，以及所述融合蛋白的构建方法和应用。本专利技术的融合蛋白是由经过修饰的小鼠Reg3 a抗菌蛋白和6个组氨酸组成，所述融合蛋白是含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的肽。上述融合蛋白的基因由编码小鼠Reg3 a成熟肽的cDNA序列、6个组氨酸cDNA序列、限制性内切酶Xho I和EcoR I位点的cDNA序列以及符合毕赤酵母表达偏好性的基因序列组成，所述融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本专利技术所述Reg3 a融合蛋白的构建方法包括如下步骤:1).表达载体的构建:SEQID N0.2所示人工合成的Reg3 a基因序列上设计有限制性内切酶的酶切位点，将Reg3a基因序列与表达质粒pwPICZalpha以同样的限制性内切酶酶切后连接在一起，通过双酶切检测，筛选出含有Reg3 a基因序列的重组表达质粒 pwPICZalpha-Reg3a ；2).酵母表达系统的构建:使用限制性内切酶线性化口《?102&1?1^-1?叩3[1，通过电转化方法将Reg3 a基因序列整合到毕赤酵母基因组中，将转化后的菌体悬液涂布于含有 Zeocin的YH)平板上，30°C培养诱导筛选单菌落出现，挑取单菌落进行小剂量诱导表达， SDS-PAGE检测表达上清确认阳性克隆；3).融合蛋白的纯化和活性检测:挑选阳性克隆菌落进行大剂量诱导表达，表达上清采用ProteinPure N1-NTA树脂和强阳离子交换树脂纯化，通过SDS-PAGE和Western blot检测纯化的融合蛋白。本专利技术Reg3a是一种优良的抗菌蛋白，抑菌圈实验检测融合蛋白的抗菌活性具有紙staphylococcus的能力，这些特点使得Reg3 a可以作为抗生素的候选替代品来进行研究。本专利技术即是基于上述抗菌蛋白和毕赤酵母的优点，以毕赤酵母表达基因工程抗菌蛋白，能够大量生产动物饲养所急需的、可以替代抗生素的动物自身基因表达的抗菌蛋白， 为市场提供无毒无害、健康的绿色产品。并且对抗菌蛋白的进一步开发和利用将产生很高的经济价值和巨大的社会效益。【专利附图】【附图说明】图1 是 ProteinPure N1-NTA 树脂纯化 Reg3 a 的 SDS-PAGE 电泳图。图2是强阳离子交换树脂纯化Reg3 a的SDS-PAGE电泳图。图3是重组Reg3 a的Western blot分析图。图4是重组Reg3a的抑菌效果图，图中:1)氨苄青霉素；2)PBS ;3)重组Reg3 a。 【具体实施方式】1、所用试剂及其配制(I)LB (Luria-Bertani)液体培养基:取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 5g，溶解于800mL ddH20 中，IOM NaOH 调节 pH 至 7.0，定容至 1000mL,高压灭菌(121°C，1.034X 105Pa)20min,4°C保存。(2) LB (Luria-Bertani)固体培养基:按每 10OOmT, ddH20 加 15g 琼脂粉，向 LB 液体培养基中加入琼脂粉，高压灭菌，4°C保存。(3)贮备液:IOXYNB (13.4%，含硫酸铵而不含氨基酸):将34g YNB和100g硫酸铵热溶于1000mLddH20中，过滤除菌，4°C保存。500 X生物素(0.02%):20mg生物素溶于IOOmL ddH20中，过滤除菌，4°C保存。IOX葡萄糖(20%):200g葡萄糖溶于1000mL ddH20中，高压灭菌,4°C保存。IOX甲醇(5%甲醇):5mL甲醇与95mL dd本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗菌功能的融合蛋白，所述融合蛋白由经过修饰的小鼠Reg3α抗菌蛋白和6个组氨酸组成，为SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范阔海，王志瑞，姜俊兵，李宏全，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：