水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，水稻基腐细菌致病菌株经无机盐培养液培养后离心取上清液，经ＡＢ－８吸附树脂柱、聚酰胺柱层析、制备薄层层析、葡聚糖凝胶获得毒素纯品Ｔ３。本发明专利技术的无机盐培养液成分简单，成本低，细菌生长快，培养２４ｈ即可用于毒素的大量提取，在水稻基腐病菌毒素分离纯化过程中，避免了使用大量有机溶剂，减少了粗毒素液浓缩步骤，方法简便，分离纯化效果好，获得的纯化毒素Ｔ３具有促进作物种子萌发后根芽生长、诱导水稻抗病防卫酶和抑菌植物病原细菌的显著作用，有望进一步开发为作物的促生剂、植物保护诱抗剂及广谱的植物病害杀菌剂等，为今后筛选降解毒素基因用于抗病基因工程的靶标奠定重要基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物保护和生物
，具体涉及一种水稻基腐病 致病细菌毒素的制备方法及其应用。
技术介绍
植物病原毒素是病原物代谢过程中产生的，在生理浓度范围内， 干扰植物正常生理功能的非酶类化合物。大多数毒素作为毒力因子增 强病害的发生程度，有些毒素为病原物致病性所必需，属于致病因子。病原微生物毒素的研究不仅对揭示病害致病机理有重要意义，而 且有着广泛的实际应用价值。(1) 在抗病育种和品种抗性鉴定中的作用利用粗毒素作为选择 压力进行品种(系)的抗病性测定，可加速杂交组合后代和抗性突变体的筛选，进而培育抗病的作物品种(系)，卢同等(2000)建立了用甘 薯青枯菌粗毒素鉴定甘薯品种抗瘟性的良好方法。庞冬辉等(1995) 用水稻稻瘟病菌产生的毒素获得了水稻抗病突变体。在杂交育种中， 用毒素处理过的花粉粒授精可明显提高后代对毒素的忍耐力。(2) 在植物病害化学防治上的应用植物病原菌毒素的研究为开 发新型杀菌剂提供了理论上的依据。杀菌剂的作用方式可以是抑制病 菌产生毒素或是钝化毒素，也可以是使寄主细胞的毒素受体失活。人 们在弄清毒素结构的基础上，利用合成的与病菌毒素相拮抗的化学物 质以毒攻毒的方式防治作物病害。1984年有人利用甘蔗眼斑病菌毒素结构类似的化合物(新型杀菌剂)或类毒素作用于病原体，部分地抑 制或限制了甘蔗眼斑病菌产生的致病毒素。(3)毒素物质的利用及开发用毒素对某些种子的萌发具有促进 或抑制作用将其进一步开发为作物的促生剂或化学抑制剂等。如小麦赤霉病菌毒素DON可以促进愈伤的生长、分化，在低浓度下可以促进 再生植株的生长，表明DON在小麦愈伤组织的诱导和分化过程中有类 似生长激素的作用。在用低浓度的棉花黄萎病菌毒素处理棉花可诱导 棉株体内一些抗病酶系的活性，用稻瘟病菌毒素处理水稻可诱发苯丙 氨酸解氨酶的活性。某些病原菌可产生胞外多糖、杂环类化合物、有机酸、蛋白脂多 糖等人工难以合成的具天然活性的复杂化合物类毒素，在商业上具有 一定的开发应用前景。利用非寄主专化性毒素可进一步研究开发生物 除草剂，叶建仁等(1999)报道了松针褐斑病菌产生的毒素对空心莲子 草、稞草等农田杂草有致萎性，为毒素的利用提供了新思路。张金林 等(2000)研究发现，葱紫斑病菌C^^/77ar^产生的毒素对稗 草有一定的抑制作用，可望开发成为除草剂。某些病原菌产生的毒素 对人、畜有毒，可通过研究、模拟其合成途径来了解其作用机理，采 取适当的措施控制其合成。细菌毒素也可以用于病害抗性工程的靶 标，张炼辉(1999)曾证实在转基因甘蔗中表达毒素降解酶能明显提 高甘蔗对病原细菌Za/ z^,愿aMiJi/7e愿的抗性。本申请人首次发现一种病原细菌一水稻基腐病细菌(￡n^'/^3 c力iT^r t力e孤'pK 能产生毒素，该毒素对病菌的致病是必需的，具有对水稻秧苗致萎和烟草细胞坏死的作用。进一步发现，低浓度毒 素能够诱导水稻抗病防卫酶活性，促进水稻、玉米、番茄和烟草等种 子萌发和植物根、芽生长，同时，毒素还具有抑制植物病原细菌的作 用。为此，建立该细菌毒素的提取、分离和纯化方法具有重要的研究 意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是替补现有技术的空白，提供一种水稻基腐病 致病细菌毒素的制备方法。本专利技术的另一个目的是提供所述水稻基腐病致病细菌毒素的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现提供一种水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，包括以下步骤(1) 水稻基腐细菌致病菌株用培养液恒温振荡培养，离心，取 上清液即粗毒素液；(2) 粗毒素液经树脂吸附柱层析分离收集流出液，进行洗脱， 并收集流分，室温风干得到活性组分；(3) 活性组分经聚酰胺柱层析获得的有活性毒素组分，制备薄 层层析，获得活性组分；(4) 活性最强组分制备薄层层析，获得水稻基腐病致病细菌毒素。经以上四个步骤得到的水稻基腐病致病细菌毒素可以经葡聚糖 凝胶柱层析纯化步骤得到纯化的单品。步骤(1)所述培养液pH7. 0，培养液组成为lmol/L的NaOH 9mL、 10% CaCl2、 2H20 6 mL、腿03 2g、蔗糖10g、 K2HP04 2g、 KH2P04 0. 5g 和蒸馏水1000mL。步骤(1)所述恒温振荡培养是在30'C下振荡培养24h;所述离 心是在4。C下10000 X g离心15min。步骤(2)所述洗脱溶剂为甲醇。步骤(3)所述薄层层析展开系统为甲醇水甲酸体积比为2:1: 0.001。步骤(4)所述制备薄层层析展剂系统为甲醇水甲酸体积比 为2: 3: 0.03混合液。本专利技术同时提供了所述水稻基腐病致病细菌毒素在促进农作物 的种子萌发方面的应用，以及对植物病原细菌的抑制作用方面的应用 和诱导水稻防卫酶活性方面的应用。前述水稻基腐细菌致病菌株是本申请人从广东佛山水稻田中，分离获得的产毒素的水稻基腐细菌致病菌株Ech7 。本专利技术的有益效果是(1) 本专利技术的无机盐培养液成分简单，成本低，细菌生长快，培养24h即可用于毒素的大量提取。(2) 在水稻基腐病菌毒素分离纯化过程中，没有使用大量有机 溶剂萃取的方法，避免了毒素化合物分解的可能，节省了有机溶剂的 使用量；应用较安全的AB-8吸附树脂，能较好吸附细菌毒素，有效 去除培养液中的无机盐成分，减少了粗毒素液浓縮歩骤，方法简便，采用制备TLC和葡聚糖凝胶方法，分离纯化效果好。(3)本专利技术获得的纯化毒素T3具有促进作物种子萌发后根芽生 长、诱导水稻抗病防卫酶和抑菌植物病原细菌的显著作用。毒素T3 有望进一步开发为作物的促生剂、植物保护诱抗剂及广谱的植物病害 杀菌剂等。对该致病细菌毒素的获得，为今后筛选降解毒素的基因， 用于抗病基因工程的靶标，奠定基础。 具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步说明本专利技术。 实施例1(1) 水稻基腐细菌致病菌株用培养液恒温振荡培养，离心，取 上清液即粗毒素液；水稻基腐细菌Ech7，先在NA培养基斜面培养24h后，接种于无 机盐培养液中，3(TC恒温振荡培养24h， 4。C下10000Xg离心15min， 弃沉淀，取上清液即粗毒素用于分离纯化。培养液配方lmol/L的 NaOH 9mL， 10% CaCl2 2H20 6 mL， NaN03 2g，蔗糖10g， K2,4 2g， KH2P04 0.5g，蒸馏水1000mL， pH7.0。(2) 粗毒素液经树脂吸附柱层析分离收集流出液，进行洗脱， 并收集流分，室温风干得到活性组分；选择安徽三星树脂有限公司的AB-8树脂粉，用20iranX300iim层 析柱，每次将6L粗毒素上清液不断加入柱中，经树脂柱吸附后，收 集流出液，收集完毕进行洗脱。洗脱时，依次用水、甲醇、乙酸乙酯 和三氯甲烷洗脱并收集流分，每种洗脱溶剂收集约250mL。室温风干后，进行生物活性测定。粗毒素经AB-8树脂柱共收集了6L流出液，以及水、甲醇、乙酸 乙酯和三氯甲烷洗脱液各250mL，生物活性测定结果表明，毒素活性 组分在甲醇洗脱液中，见表l。表1吸附树脂洗脱活性测定<table>table see original document page 9</column></row><table>(3)活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻基腐病致病细菌毒素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（１）水稻基腐细菌致病菌株用培养液恒温振荡培养，离心，取上清液即粗毒素液；（２）粗毒素液经树脂吸附柱层析分离收集流出液，进行洗脱，并收集流分，室温风干得到活性组分；（３）活性组分经聚酰胺柱层析获得的有活性毒素组分，制备薄层层析，获得活性组分；（４）活性最强组分制备薄层层析，获得水稻基腐病致病细菌毒素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘琼光，王振中，罗建军，王玉涛，张静一，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]