本发明专利技术公开了霍乱毒素Ｂ亚单位和蚓激酶融合基因及包括该基因的重组载体及宿主细胞，霍乱毒素Ｂ亚单位和蚓激酶融合基因是由序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０所示的核苷酸序列。本发明专利技术的优点在于由ＣＴＢ和ＬＫ融合而成的融合基因，通过毕赤酵母ＧＳ１１５能高效表达ＣＴＢ与ＬＫ融合蛋白，其表达系统的产率较高，毕赤酵母表达稳定，应用十分广泛，经纯化的融合蛋白经检验具有生物学活性，可以制备成为融合蛋白药物，融合蛋白药物对治疗血栓有明显功效，同时ＣＴＢ作为佐剂可明显提高ＬＫ的口服吸收利用率，大大提高了ＬＫ的药效作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域基因重组技术，具体涉及一种融合基因以及基因工程菌的构建 方法。
技术介绍
蚓激酶(Lumbrokinase， LK)，又称作蚯虫引纤溶酶(Earthworm plasminogen activator, EPA)， 是从蚯弼l体内提取的一种具有纤溶活性的蛋白水解酶。它广泛分布于蚯蚓的消化道内腔中， 能直接降解血中纤维蛋白原并激活纤溶酶原为纤溶酶。大量研究表明蚓激酶无论静脉或口服 给药，均具有溶栓作用。顿激酶既可直接溶栓，又能激活溶栓；并能降低血小板聚集率(抑制 内源凝血功能亢进)，促进血管内皮细胞产生t-PA，并抑制PAI生成(增强内源纤溶活性)， 抑制内皮素(ET)的縮血管作用(舒张平滑肌，缓解血管痉挛)，降低血液粘度(促进微循环)。作 为溶栓药物，顿激酶先后在韩国和中国上市，在脑血管血栓性疾病治疗中显示出明显的疗效。 霍乱毒素(CT)是由霍乱弧菌产生的分子量为84kD的肠毒素，由1个A亚早位(CTA)和5 个B亚单位(CTB)形成的五聚体共价连接而成。CTA为毒性亚单位，CTB为无毒的受体结合 亚单位，可以和所有,有核细胞膜上的神经节苷脂(GM1)受体结合。A亚单位通过B亚单位的 作用进入细胞发挥其毒性作用 Microl， Rew. 1992， 56: 622-643]。 CTB具有较强的免 疫佐剂活性，特别是当其经化学方法或基因融合技术使其与不相关抗原形成偶联蛋白或融合 蛋白时，其免疫佐剂活性强于其与不相关抗原混合免疫时的佐剂活性。由于CTB可以和所有 有核细胞膜上的神经节苷脂(GM1)受体结合，基于此特性，研究发现CTB不仅可以用于免 疫佐剂，还能够作为有效的药物呈递载体。药物在肠道中的通透性成为药物蛋白穿过肠上皮 细胞进入血液循环系统的主要障碍。然而受体接导的口服呈递系统为药物蛋白的吸收提供了 可行的途径。为了验证CTB是否能够成为有效的蛋白药物呈递载体，Arati等人将CTB与 GFP蛋白基因，并在烟草叶绿体中实现了表达。用这种烟草喂食小鼠，并对服用这种烟草的 小鼠作了详尽的生理生化分析。 在这项研究中，他们发现，CTB-GFP融合蛋白能被肠道上皮细胞和肠相关淋巴组织吸收。五 聚体融合蛋白能够结合到细胞膜表面的GM1受体上，并通过胞吞作用进入吞噬小体。随后这种融合蛋白进入内质网，在此处，胞内广泛存在的Furin酶将融合蛋白切开，CTB和GFP蛋 白分开，CTB被带到细胞的基底一侧，仍然与GM1受体结合着。而GFP分子则通过高尔基 体被排除细胞外，从而进入淋巴循环，进一步进入血液循环系统。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种CTB和LK融合基因。 本专利技术的第二个目的是提供一种构建含CTB与LK融合基因的毕赤酵母表达载体 pPIC9k-Cr5-Fw〃力-丄^。本专利技术的第三个目的是提供一种含有CTB和LK融合基因工程菌。 本专利技术的第四个目的是提供一种CTB和LK融合基因编码的蛋白。 本专利技术的第五个目的是提供CTB和LK融合基因编码的蛋白在制备口服溶栓药物中的应用。本专利技术的技术方案概述如下一种霍乱毒素B亚单位和蚓激酶融合基因，由序列表中SEQ ID NO.10所示的核苷酸序 歹U，所述霍乱毒素B亚单位简写为CTB，所述蚓激酶简写为LK。一种含CTB与LK融合基因的重组载体pPIC9k-Cr5-F^/"-i^:,由下述步骤构建而成(1) 构建含有CTB与LK融合基因的中间载体pBluescript SK-C7^-i^r/"-^::① 将SEQ ID NO.l所示的CTB基因和SEQ ID N0.3所示的柔性肽连接序列基因用全合成方 法连接，置于载体pBluescript SK-C7^;② 将SEQ ID N0.2所示的LK基因用全合成方法合成置于载体pUCm-T-iX;③ 设计由SEQ ID N0.5所示的上游引物Pl，和由SEQ ID N0.6所示的下游引物P2，以 pUCm-T-i:A:质粒为模板，进行PCR扩增，获得Furin-LK融合基因，所述Furin基因序列如 SEQ ID N0.4所示； 将Furin-LK融合基因经五coRI和///"dill双酶切，将载体pBluescript SK-C715经￡coRI和 历"dIII双酶切，二者进行连接反应，得到含SEQ ID NO.l所示的CTB基因、SEQ ID N0.3 所示的柔性肽连接序列基因、SEQ ID N0.4所示的Fw/w基因和SEQ ID N0.2所示的LK基因 的中间载体pBluescript SK-Cr5-Fw〃"-ZA:;(2) 构建表达载体pPIC9k-C7^-尸wW"-丄/::设计由SEQ IDN0.7所示的上游引物P3，和由SEQ ID N0.8所示的下游引物P4，以pBluescript SK-Cra-Fwn77-iX为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经M^I酶切，将毕赤酵母表达 载体pPIC9k经酶切，二者进行连接反应，得到含CTB与LK融合基因的重组载体 pPIC9k-C7^-F,'w-仏一种含CTB和LK融合基因工程菌，将pPIC9k-C7^-Fw/"-Lfi:线性化后整合于毕赤酵母 GS115的基因组上。一种由CTB和LK融合基因编码的蛋白，是序列表中SEQ IDN0.9所示氨基酸序列。一种CTB和LK融合基因编码的蛋白在制备口服溶栓药物中的应用。 .本专利技术的优点在于由CTB和LK融合而成的融合基因，通过毕赤酵母GS115能高效表达 CTB与LK融合蛋白，其表达系统的产率较高，毕赤酵母表达稳定，应用十分广泛，经纯化 的融合蛋白经检验具有生物学活性，可以制备成为融合蛋白药物，融合蛋白药物对治疗血栓 有明显功效，同时CTB作为佐剂可明显提高LK的口服吸收利用率，大大提高了LK的药效 作用。附图说明图1 pPIC9k-C7^-Fwn力-丄咒酶切及PCR验证结果。 图2毕赤酵母菌落PCR产物电泳结果。 图3发酵粗提液SDS-PAGE蛋白质电泳结果。 图4小鼠尾部血栓长度测量结果。具体实施例方式实施例1中间载体pBluescript SK-Cr5-Fwn'"-丄AT的构建首先，将SEQ ID NO.l所示的CTB基因和SEQ ID N0.3所示的柔性肽连接序列基因用 全合成方法连接，置于载体pBluescript SK-Cr5;将SEQ ID N0.2所示的LK基因用全合成方 法合成置于载体pUCm-T-丄《。其次，以pUCm-T-iX为模版，PI和P2分别为上下游引物扩 增LK片段，其反应条件为94°C， 30s， 55°C， 30s, 72°C， 90s，循环30次。在PI中引入 五coRI酶切位点(GAATTC)，在P2中引入历wdlll酶切位点(AAGCTT)。然后，PCR产物 与pBluescript SK-Cra质粒分别经&oRI和历wdUI双酶切，将二者酶切产物连接16°C，过 夜连接(2 pi 10xT4 buffer, 0.5 pi T4 DNA连接酶，5 pi载体DNA， 7.5 pi外源DNA， 5 pi ddH20)。连接产物转化￡-Co//. Z)^5ct，涂布于含氨苄的LB平板。以目的基因为引物进行PCR 得到85本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种霍乱毒素Ｂ亚单位和蚓激酶融合基因，其特征是由序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０所示的核苷酸序列，所述霍乱毒素Ｂ亚单位简写为ＣＴＢ，所述蚓激酶简写为ＬＫ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：季静，王罡，关春峰，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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