使用植物细胞高效地生产志贺毒素蛋白质等的细菌毒素蛋白质。志贺毒素蛋白质等细菌毒素蛋白质是这样生产的：用含有下述DNA的DNA构建物转染植物细胞，使植物细胞生产上述细菌毒素蛋白质，所述DNA是编码介由具有以下特征（A）和（B）的肽而串联连接的杂化蛋白质的DNA，（A）氨基酸的个数为12～30个；（B）脯氨酸的含有率为20～35％。
【技术实现步骤摘要】
细菌毒素疫苗本申请是基于以下中国专利申请的分案申请:原案申请日:2009年4月28日原案申请号:CN200980116606.9 (PCT/JP2009/058345)原案申请名称:细菌毒素疫苗
本专利技术涉及用于应对由志贺毒素、霍乱毒素、大肠杆菌易热性毒素等细菌毒素引起的疾病的疫苗的杂化蛋白质以及用于生产该杂化蛋白质的DNA构建物。
技术介绍
志贺毒素(Stx、~口毒素)是病原性大肠杆菌中肠管出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli)产生的蛋白质性外毒素。志贺毒素引起出血性肠炎、溶血性尿毒症症候群、脑病等。志贺毒素大致分为Stxl和Stx2，分别还可以再分成小类。Stx2可以例举引起猪水肿病的Stx2e。已知猪水肿病高发于断奶后I~2周的幼猪。水肿病菌的感染导致的致死率高达50~90%。此外,霍乱毒素(CT)是霍乱杆菌(Vibrio cholerae)产生的蛋白质性外毒素。已知CT引起剧烈的腹泻和呕吐。·此外，大肠杆菌易热性毒素(LT)是毒素原性大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichia coli)产生的蛋白质性内毒素。已知LT引起腹湾和呕吐。已知Stx、LT、CT中任何一种细菌毒素均是由与细胞附着有关的B亚单位5倍体和具有毒性的A亚单位I倍体构成。此外，已知LT和CT在结构上和功能上都很类似。作为由这些细菌毒素引起的疾病的预防方法，已知的有通过注射或经鼻喷雾的方式给予疫苗或者口服疫苗的方法。例如，已知有用重组大肠杆菌生产无毒化的Stx2e蛋白质、通过注射投予给猪的技术(非专利文献I)。但是，存在以下问题:利用重组大肠杆菌的无毒化Stx2e蛋白质的产量不够；通过注射投予疫苗需要花费人力等。此外，从减轻劳动力的观点，口服投予疫苗的方法在畜产领域受到高度专注。在这样的背景下，开发了使用转基因技术使植物产生细菌毒素蛋白质的技术。例如，记载了含有编码LT蛋白质的B亚单位(LTB)的DNA、表达该DNA的转基因植物(专利文献1、专利文献2)。此外，还记载了表达编码LT蛋白质或CT蛋白质的DNA的转基因植物(专利文献3)。但是，这些技术存在蛋白质的产量不足的问题。此外，报告了让莴苣生产LTB的例子(非专利文献2)。在该研究中，使用植物高表达启动子一花椰菜花叶病毒(力U 7 9 7 — --Μ夕々^ ^ ^ ) 35S RNA启动子(CaMV35S)和增强子一Kozak序列，在莴苣内表达改变了密码子的LT蛋白质的B亚单位的基因。结果，报告LT蛋白质的B亚单位蓄积了莴苣的总可溶性蛋白质的约2.0质量％。但是，以这种程度的蛋白质的蓄积量，对于利用转基因植物有效地防除细菌病还是不够。即，有必要使目的细菌毒素蛋白质在植物细胞内有效地生产、蓄积。专利技术人发现:通过用来自植物的醇脱氢酶基因的5'-非翻译区(ADH5’UTR)来表达来自植物的分泌信号肽加成在氨基末端的Stx2e蛋白质，可以使莴苣等植物有效地生产Stx2e蛋白质、在植物体内高浓度蓄积,并申请了专利(专利文献4)。 【专利文献I】日本专利特表平10-507916号公报【专利文献2】日本专利特开2000-166411号公报【专利文献3】日本专利特表2002-533068号公报【专利文献4】国际公开第2009/ 004842号小册子【非专利文献I】Makino 等,Microbial Pathogenesis, 31 卷,N0.1, 2001 年 7月,pp.1-8(08)【非专利文献2】Kim 等，Protein Expression and Purification, 51卷，N0.1, 2006 年 I 月，pp.22-27 (06)
技术实现思路
本专利技术的课题是，用植物细胞来更有效地生产Stx蛋白质以及具有与Stx蛋白质类似的高次结构的其他细菌毒素蛋白质。专利技术人使植物细胞生产杂化蛋白质，所述杂化蛋白质是2或3个Stx2e、CT等细菌毒素的蛋白质介由特定序列的肽串联连接的杂化蛋白质，结果成功地做到细菌毒素的蛋白质在植物细胞内高浓度蓄积，并完成了本专利技术。SP，本专利技术如下所述。(I) 一种杂化蛋白质，是2或3个志贺毒素蛋白质、霍乱毒素蛋白质或大肠杆菌易热性毒素蛋白质分别介由具有以下特征(A)和(B)的肽而串联连接的杂化蛋白质，(A)氨基酸的个数为12~30个；(B)脯氨酸的含有率为20~35%。(2)如(I)记载的杂化蛋白质，上述肽还具有以下特征(C)，(C)脯氨酸是每隔2氨基酸配置或每隔3氨基酸配置。(3)如(2)记载的杂化蛋白质，上述肽含有序列号2、82或84所示的氨基酸序列。(4)如(3)记载的杂化蛋白质，2个志贺毒素蛋白质、霍乱毒素蛋白质或大肠杆菌易热性毒素蛋白质介由含有序列号2所示的氨基酸序列的肽串联连接。(5)如(I)~(4)任意一项记载的杂化蛋白质，志贺毒素蛋白质是志贺毒素蛋白质的B亚单位。(6)如(I)~(5)任意一项记载的杂化蛋白质，志贺毒素蛋白质是Stx2e蛋白质。(7)如(I)~(4)任意一项记载的杂化蛋白质，霍乱毒素蛋白质是霍乱毒素蛋白质的B亚单位。(8)如(4)记载的杂化蛋白质，具有序列号10、12、14或16所示的氨基酸序列。(9)如(3)记载的杂化蛋白质，具有序列号86、88、90、92、94、96、98或100所示的氨基酸序列。(10)如(I)~(9)任意一项记载的杂化蛋白质，来自植物的分泌信号肽加成在氨基末端。(11)如(10)记载的杂化蛋白质，内质网残留信号肽加成在羧基末端。(12) (I)~(9)任意一项记载的杂化蛋白质，叶绿体转移信号肽加成在氨基末端。(13)—种DNA构建物，含有编码(I)~(12)任意一项记载的杂化蛋白质的DNA。(14)如(13)记载的DNA构建物，含有具有序列号9、11、13或15所示的碱基序列的 DNA。(15)如(13)记载的DNA构建物，含有具有序列号85、87、89、91、93、95、97或99所不的喊基序列的DNA。(16)如(13)~(15)任意一项记载的DNA构建物，编码杂化蛋白质的DNA在来自植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区可表达地连接。(17)如(16)记载的DNA构建物，上述来自植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区来自烟草。(18)如(17)记载的DNA构建物，具有序列号24~29任意一项所示的碱基序列。(19)如(17)记载的DNA构建物，具有序列号101~111任意一项所示的碱基序列。(20)—种重组载体，含有(13)~(19)任意一项记载的DNA构建物。(21) —种转染子(形质转换体，transfectant)，被(20)记载的重组载体转染。(22)如(21)记载的转染子，转染子是转染植物细胞或转染植物。(23)由(21)或(22)记载的转染子得到的种子。(24)由序列号2、82或84所示的氨基酸序列构成的肽。【附图说明】【图1】表示Stx2eB表达载体的图案的图。图中，一表示翻译开始点、▽表示翻译后被切断的部位。【图2】在使用了莴苣原生质体的一时性表达实验中得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。【图3】在使用了莴苣原生质体的一时性表达实验中得到的、表示CTB的蓄积水平的照片。【图4】表示本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种杂化蛋白质，是2或3个志贺毒素蛋白质Stx2e蛋白质的B亚单位、霍乱毒素蛋白质的B亚单位或大肠杆菌易热性毒素蛋白质的B亚单位分别介由具有以下特征（A）、（B）、（C）和（D）的肽而串联连接的杂化蛋白质，（A）氨基酸的个数为12～30个；（B）脯氨酸的含有率为20～35％；（C）脯氨酸是每隔2氨基酸配置或每隔3氨基酸配置；（D）脯氨酸以外的氨基酸中，丝氨酸以及甘氨酸的合计含有率为70%以上。
【技术特征摘要】
2008.05.02 JP 2008-1205731.一种杂化蛋白质，是2或3个志贺毒素蛋白质Stx2e蛋白质的B亚单位、霍乱毒素蛋白质的B亚单位或大肠杆菌易热性毒素蛋白质的B亚单位分别介由具有以下特征(A)、(B)、(C)和(D)的肽而串联连接的杂化蛋白质， (A)氨基酸的个数为12~30个； (B)脯氨酸的含有率为20~35%； (C)脯氨酸是每隔2氨基酸配置或每隔3氨基酸配置； (D)脯氨酸以外的氨基酸中，丝氨酸以及甘氨酸的合计含有率为70%以上。2.如权利要求1记载的杂化蛋白质，其中，所述肽的(A)氨基酸的个数为12~22。3.如权利要求1记载的杂化...
【专利技术属性】
技术研发人员：泽田和敏，吉田和哉，松井健史，
申请(专利权)人：出光兴产株式会社，国立大学法人奈良先端科学技术大学院大学，
类型：发明
国别省市：
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