犬、猫长效融合干扰素及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种由犬、猫血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No1或2所示。本发明专利技术的犬、猫长效融合干扰素以延长干扰素半衰期、提高干扰素动物体内生物学活性，可以降低干扰素医疗制剂的成本，应用于犬、猫等动物疾病的防治工作中。

【技术实现步骤摘要】
犬、猫长效融合干扰素及其制备方法与应用
本专利技术涉及动物疾病预防治疗
，具体地涉及犬、猫长效融合干扰素及其制备方法与应用。
技术介绍
干扰素(Interferon, IFN)是一类重要的细胞因子,是生物体细胞受到病毒或其它异源物质诱生剂做用而产生的分泌型糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞增殖、免疫调节等多种生物作用，对病毒病、细菌病、肿瘤等疾病都有良好的治疗效果。但是干扰素在临床应中半衰期短、在机体内易发生降解，这些难题限制了干扰素生物作用的完全发挥，直接影响了干扰素在临床中的有效应用，所以如何延长干扰素半衰期，提高干扰素生物学活性的发挥效果成为研究的重点。目前除了 PEG、微囊缓释技术等化学、物理修饰方法外，还有利用基因工程方法对干扰素蛋白进行重组改造，这些方法都显示出了广泛的应用前景。当前已经投入临床使用的犬、猫干扰素制品，均为原核表达系统表达生产的基因工程重组干扰素。这些产品没有进行改良，其半衰期短，且成本高，限制了干扰素制品的实际应用。目前，已有将人血清蛋白和干扰素α基因融合，通过基因重组表达技术获得重组人血清白蛋白干扰素α融合蛋白，可以有效延长药物蛋白的半衰期。但是，利用INFa与HSA融合蛋白是极其复杂的，如何设计融合蛋白的结构，使两者都能保持相对独立的生物学活性；如何构建高表达菌株并分离制备高纯度的融合蛋白，对获得的融合蛋白结构和生物学功能鉴定均需要进行充分的研究。目前还未见融合蛋白延长干扰素半衰期的方法在犬、猫干扰素中的应用。
技术实现思路
本专利技术目的是提供犬、猫长效融合干扰素，以用于犬、猫类动物疾病的临床防治。本专利技术另一目的是提供编码上述犬、猫长效融合干扰素的基因。本专利技术又一目的是提供上述犬、猫长效融合干扰素的制备方法，以适用于工业扩大化生产。本专利技术再一目的是提供上述犬、猫长效融合干扰素在制备治疗犬、猫类动物疾病的药物中的应用。本专利技术的犬长效融合干扰素的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，全长777个氨基酸组成，自氨基末端第I位至第608位为犬血清白蛋白，自氨基末端第614位至第777位为犬干扰素a，自氨基末端第609位至613位为柔性linker，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。本专利技术的猫长效融合干扰素的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，全长883个氨基酸组成，自氨基末端第I位至第690位为猫白蛋白，自氨基末端第696位至第883位为猫干扰素ct ,自氨基末端第第691位至695位为柔性linker,编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。本专利技术还提供含有上述基因的的表达载体，含有上述融合蛋白或基因或表达载体的工程菌。本专利技术还提供扩增上述基因中任一片段的引物序列。本专利技术的犬、猫长效融合干扰素是用犬、猫血清白蛋白作为干扰素的修饰及稳定保护剂，将血清白蛋白和干扰素基因用柔性Linker基因连接后插入到酵母多拷贝表达载体pPIC3.5k的多克隆酶切位点区，并利用同源重组方法将表达基因重组进酵母基因组中，发酵培养重组酵母、诱导融合蛋白表达，纯化得到犬、猫长效融合干扰素融合蛋白。具体地，本专利技术犬、猫长效融合干扰素的制备工艺，包括以下步骤:1、基因扩增与质粒构建:根据犬、猫血清白蛋白基因设计引物，PCR扩增得到犬、猫血清白蛋白基因的开放阅读框，以犬、猫血清白蛋白天然信号肽作为融合蛋白的表达信号肽，在犬、猫血清白蛋白N端引入EcoR I酶切位点基因、C端去除终止密码子后引入柔性Linker基因及酶切位点BamH I酶切位点基因；根据犬、猫干扰素基因设计引物，PCR扩增得到犬、猫干扰素基因的开放阅读框，去掉干扰素基因起始密码子，在犬、猫干扰素基因N端与C端分别引入Bgl II, EcoR I酶切位点基因，用T4连接酶对犬、猫血清白蛋白基因与犬、猫干扰素基因在BamH I和Bgl II酶切位点处连接，并将连接的犬、猫血清白蛋白-干扰素融合基因插入经过EcoR I酶切的PPIC3.5k、pPIC9k或其它毕赤酵母表达载体中，分别构建犬、猫血清白蛋白-干扰素融合蛋白重组表达载体质粒；2、酵母转化与诱导培养:用同源重组法将经Sal I酶切线性化的重组表达载体转化入酵母真菌SMD1168、GS1 15或其它毕赤酵母真菌基因组中，以甘油为唯一碳原和能源的培养基发酵培养重组酵母，以甲醇为唯一碳原和能源的培养基诱导表达融合蛋白；3、蛋白纯化与活性检测:表达蛋白产物经SDS-PAGE电泳分析蛋白表达产物，经超滤浓缩、亲和层析、脱盐层析纯化，采用体外细胞攻毒和体内接种后相关细胞因子检测的方法检测长效融合干扰素蛋白的生物学活性。本专利技术还提供一种用于治疗多种肿瘤及病毒性疾病的药物，所述药物含有上述融合蛋白。所述药物还包括加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂等。本专利技术旨在于利用犬血清白蛋白(CSA)和猫血清白蛋白(FSA)的运输和稳定性调节功能，使干扰素免受胰蛋白酶等消化酶的降解破坏，也可以降低动物肾小球滤过系统对干扰素融合蛋白代谢排除率，分别对犬干扰素(cIFN)、猫干扰素(HFN)进行融合修饰，分别制备犬血清白蛋白-干扰素(CSA-cIFN)融合蛋白、猫血清白蛋白-干扰素(FSA-flFN)融合蛋白，不仅延长了动物干扰素的半衰期，还有效的提高了干扰素动物机体内的治疗及免疫调节功能，并充分发挥干扰素的生物学活性，达到更好的对动物疾病的防治目的。[0021 ] 本专利技术的积极效果在于:选用了犬、猫血清白蛋白与干扰素进行融合表达制备犬长效融合干扰素、猫长效融合干扰素，以延长干扰素半衰期、提高干扰素动物体内生物学活性和治疗效果。本专利技术获得的犬、猫长效融合干扰素制剂以酵母表达制备融合蛋白，下游的蛋白纯化工艺简便，产品成本降低，也更利于融合干扰素制品的推广，应用于犬、猫等动物疾病的防治工作中。【附图说明】图1为pPIC3.5k-CSA-cIFN载体构建示意图；图2为pPIC3.5k_FSA-fIFN载体构建示意图；图3为犬、猫重组干扰素融合蛋白SDS-PAGE鉴定图。【具体实施方式】以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1犬、猫长效融合干扰素的制备分别以CSA、FSA、cIFN、fIFN，进行重组犬、猫血清白蛋白-干扰素融合蛋白表达载体的构建。犬、猫血清白蛋白-干扰素融合蛋白的制备步骤:1、参照犬血清白蛋白(CSA)基因(NM_001003026.1 )、猫血清白蛋白(FSA)基因(NM_001009961.1)序列开放阅读框及酵母表达载体pPIC3.5k物理图谱设计引物并引入酶切位点，其间保留血清白蛋白天然信号肽，去除血清白蛋白终止密码子，去除干扰素信号肽、起始密码子。(I) CSA 上游引物:CSAl:5' -GCGAATTCGCCATGAAGTGGGTAACTTTTATTTCCCTCTTCTTTC-3',其中 5' 端含有EcoR I酶切位点；CSA下游引物:CSA2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由犬、猫血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No1或2所示。

【技术特征摘要】
1.一种由犬、猫血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID Nol或2所示。2.编码权利要求1或2所示融合蛋白的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No3或4所示。4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。5.含有权利要求1所述融合蛋白的宿主细胞。6.含有权利要求2或3所述基因的宿主细胞。7.一种制备权利要求1所述融合蛋白的方法，包括以下步骤:将权利要求4所述的表达载体导入宿主细胞，诱导表达得到融合蛋白。8.根据权利要求7所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏振强，郑文文，夏晓红，段旖，
申请(专利权)人：长春西诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：