金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白，是由IsdB免疫优势片段（IsdBid）和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区域（ClfAN3）融合而成的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明专利技术还提供了该融合蛋白的编码基因、制备方法以及在制备预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗中应用。本发明专利技术的ITC融合蛋白含有多种抗原，因此免疫效果好，提高了抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用，结果与ClfA、IsdB和TraP任意单个蛋白免疫结果相比较，ITC融合蛋白免疫效果优于单个蛋白的免疫效果，并且由于ITC包含分子量较小的Trap和有两种抗原的免疫优势片段，使得肽链长度不会过长，利于体外表达，在预防金黄色葡萄球菌新型疫苗的开发应用方面具有重要价值。

【技术实现步骤摘要】
金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白及制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学和基因工程领域，涉及一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白及制备方法和应用，即将IsdB免疫优势片段和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区域融合而成的ITC融合蛋白及制备方法和应用。
技术介绍
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)是一种革兰氏阳性菌，既是引起人类多种感染的主要病原菌，也是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。但随着临床上抗生素在S.aureus感染治疗中的普遍使用，已出现了大量S.aureus耐药菌株,致使抗生素治疗收效甚微，甚至毫无效果。因此，对S.aureus感染的免疫预防和免疫治疗成为人们现在研究的焦点。在过去的40多年里,人们对S.aureus全菌灭活苗、荚膜多糖结合苗、类毒素、菌体表面粘附素以及菌体结构蛋白亚单位苗等作了大量研究，但免疫保护效果都不令人满意。近年来，随着对S.aureus认识的不断深入和对S.aureus苗的研究探索,使人们意识到使用单一抗原分子作为免疫原进行免疫，其所提供的免疫保护作用有限。而使用S.aureus多种以上抗原制成疫苗会使免疫保护作用得到进一步提高。Isd 是 S.aureus 铁调节表面决定族(Iron-regulated surface determinant)的缩写，包括IsdB、IsdA, IsdH等多个成分。Kuklin等报导，Isd家族成员——IsdB在各种S.aureus株中高度保守，将表达的IsdB用硫羟磷酸铝佐剂制备免疫原免疫小鼠，证实该疫苗具有高度的免疫原性，能显著降低小鼠致死率。TraP(Target of RNAIII ActivatingProtein)是一个由167个氨基酸残基组成的蛋白质，在葡萄球菌中高度保守。它能够被RNAIII激活蛋白(RAP)激活，而且研究认为TraP在葡萄球菌应激反应中发挥作用，可保护DNA免受氧化损伤、自然突变和适应性突变。本实验室曾对表达的IsdB、TraP和RAP的免疫保护作用进行了比较研究，结果IsdB、TraP和RAP均能够刺激小鼠产生良好的体液免疫应答和高水平的细胞因子(IL-4、IFN-Y )，在小鼠败血症模型中用不同菌株攻毒，其免疫保护效果TraP略优于IsdB，IsdB略优于RAP。本实验室的进一步研究证实，将IsdB免疫优势片段126-361aa与TraP进行融合表达，获得的融合蛋白的免疫原性和免疫保护作用得到进一步提高。ClfA是凝集因子A (clumping factor A, ClfA)的缩写,是S.aureus黏附于寄主细胞的最主要的黏附因子之一。ClfA可以介导S.aureus黏附到宿主基质蛋白上，也可以与纤维蛋白原结合而使S.aureus得到保护，从而起到抗吞噬作用，而且ClfA几乎表达于所有的S.aureus表面 。ClfA由933个氨基酸残基构成，分为S、A、R、W、M和C区。其中A区结构域共约500个氨基酸残基组成，可分为三个亚区，即N1、N2和N3。经研究证实ClfA的N2N3具有免疫保护作用，可以用于治疗或预防S.aureus感染。目前，使用上述几种抗原联合起来制备预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白，将金黄色葡萄球菌的多种抗原进行串联表达，克服现有的单一抗原分子作为免疫原进行免疫，其所提供的免疫保护作用有限的问题。本专利技术的第二目的是提供上述ITC融合蛋白的编码基因。本专利技术的第三目的是提供上述ITC融合蛋白的制备方法。本专利技术的第四目的是提供上述ITC融合蛋白的用途。本专利技术通过以下技术方案来实现:一、一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白，是由IsdB免疫优势片段(IsdBid)和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区(ClfAm)融合而成的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所/Jn ο二、编码上述的ITC融合蛋白的基因，其具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。三、上述的ITC融合蛋白的制备方法，其特征在于:该方法包括以下步骤:(I)ClfA优势片段的筛选，得到ClfAN3 ；(2)金黄色葡萄球菌IsdBid、TRAP、ClfAn3的基因克隆；(3)采用重叠延伸PCR技术将IsdBid、TRAP、ClfAn3这三个基因用连接序列连接成ITC融合蛋白的编码基因；(4)将ITC融合蛋白的编码基因构建入表达载体进行原核表达得到融合蛋白。四、上述的ITC融合蛋白在制备预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗中应用。采用上述技术方案的积极效果:本专利技术的ITC融合蛋白是由金黄色葡萄球菌的IsdB免疫优势片段IsdBid和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区域ClfAN3融合而成，由于含有多种抗原，因此免疫效果更好，提高了抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用，结果与ClfA、IsdB和TraP任意单个蛋白免疫结果相比较，融合蛋白免疫效果优于单个蛋白的免疫效果，并且由于同时含有多种抗原的免疫优势片段，使得肽链长度不会过长，利于体外表达，同时使得制备预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗的制备过程大大简化，在新型疫苗开发应用方面具有重要的价值。【附图说明】图1是ClfAN2N3片段分段的生物信息学分析结果；图A为ClfA_结构域片状图，图B为ClfA N3结构域片状图，图C为ClfA N2结构域片状图，图D为ClfA N2N3结构域空间构象图，图E、F为ClfA N2N3结构域的片状结构和空间构象图的融合；图2是clfA N2N3基因的PCR产物的电泳分析结果；M:DNA Marker DL2000 ；1:clfA N2N3 ；图3是clfA N2基因的PCR产物的电泳分析结果；M:DNA Marker I ；1:clfA N2 ；图4是clfA N3基因的PCR产物的电泳分析结果；M:DNA Marker I ；1:clfA N3 ；图5是clfA N2N3基因的PCR产物回收的电泳分析结果；M:DNA Marker DL2000plus II ；1:clfA N2N3 ；图6是clfA N2基因的PCR产物回收的电泳分析结果；M:DNA Marker I ；1:clfA N2 ；图7是clfA N3基因的PCR产物回收的电泳分析结果；M:DNA Marker I ；1:clfA N3 ；图8是PCR鉴定表达载体重组质粒pET-ClfA N2N3 ；M:DNA Marker DL2000plus II ；1:pET_ClfA N2N3 ；图9是PCR鉴定表达载体重组质粒pET-ClfA N2 ；M:DNA Marker I ；1:pET-ClfA N2 ；图10是PCR鉴定表达载体重组质粒pET-ClfA N3 ；M:DNA Marker I ；1:pET-ClfA N3 ；图11是酶切鉴定表达载体重组质粒pET-ClfA ；M:DNA Marker DL2000plus II ；1:pET-ClfA N2N3 酶切结果；2:pET-ClfA N2 酶切结果；3:pET-ClfA ^酶切结果；图12是分段表达的重组蛋白和纯化后的蛋白的SDS-PAGE结果；图A:ClfAn2n3 ;图 B =Clf本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白，是由IsdB免疫优势片段（IsdBid）和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区域（ClfAN3）融合而成的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白，是由IsdB免疫优势片段(IsdBid)和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区域(ClfAN3)融合而成的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。2.编码权利要求1所述的ITC融合蛋白的基因，其具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列。3.权利要求1所述的ITC融合蛋白的制备方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)ClfA...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔玉东，朱战波，于立权，陈龙欣，李闰婷，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：