本发明专利技术公开了一种新型钠肽，该新型钠肽由脑钠肽和蛇钠肽连接组成；脑钠肽位于所述新型钠肽的N端，且蛇钠肽位于新型钠肽的C端；其中，脑钠肽包括由两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构。其制备方法包括：获取脑钠肽基因和蛇钠肽基因，通过PCR方法拼接合成新型钠肽基因；构建包括新型钠肽基因的表达质粒；将表达质粒转化至适宜表达菌株中进行诱导培养，诱导新型钠肽的表达。本发明专利技术的新型钠肽同时具有脑钠肽及蛇钠肽的特性，特异性作用显著增强，药物半衰期明显延长；本发明专利技术的制备方法工艺简单、切实可行；具有新型钠肽的基因工程药物可有效作用心脏、血管及肾脏等效应器官，并有效保护上述器官的功能、预防和治疗心脏及肾脏衰竭等疾病。
【技术实现步骤摘要】
新型钠肽、制备方法及其在制备基因工程药物中的应用
本专利技术属于生物制药
，涉及一种基于基因工程技术制备的新型钠肽。更具体地，本专利技术涉及由脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)和蛇钠肽(dendroaspisnatriuretic peptide,DNP)组成的基因工程新型钠肽(BDNP)、制备方法及其在制备用于治疗心血管疾病和肾脏疾病等方面的基因工程药物中的应用。
技术介绍
迄今为止已发现多种利钠肽，例如心钠肽、脑钠肽、C型钠肽、尿钠肽及蛇钠肽等等。它们虽然有一些结构上的区别，但具有以下共同的生理作用:利钠肽通过与血管壁上的过氧化物酶体增殖物活化受体结合，激活鸟苷酸环化酶，引起心脏、血管、肾脏等组织细胞内环化鸟苷酸(cGMP)的浓度升高和平滑肌细胞的舒张；作为第二信使，cGMP能扩张动脉和静脉，并可快速降低全身外周动脉压、肺毛细血管楔压、肺动脉压、右房压，从而降低心室的前后负荷；利钠肽治疗能拮抗内皮素、去甲肾上腺素和醛固酮过度激活产生的心脏毒性，从而扩张肾小球的入球小动脉、抑制近曲小管对钠的吸收，使肾小球滤过率和钠排泄增加，产生明显的利尿和利尿钠作用，但不增加尿钾排泄，对肾脏的直接作用是有益的。通过上述机制利钠肽可降低心室后负荷，通过减少肾素和醛固酮的分泌和拮抗垂体后叶加压素和交感神经活性，起到排钠、利尿、降压的作用，使循环血容量降低，减轻了心室的前负荷，改善血管和肾脏的血流动力学平衡。另外，利钠肽抑制转化生长因子诱导的心肌纤维化、抑制炎性因子基因的上调表达及心肌纤维母细胞繁殖分化和胶原合成，进而逆转心室重构。脑钠肽(BNP)最初从猪脑中分离得到，BNP前体的多肽序列在物种间具有高度同源性。人的脑钠肽由32个氨基酸组成(图1所示)，并包含由两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构。正常心肌细胞合成分泌BNP，病变心肌(例如心肌肥厚、心肌梗死和心力衰竭)也可诱导其产生。BNP与利钠妝受体A (Natriuretic peptide Areceptor, NPRA)结合，激活鸟苷酸环化酶，提高胞内cGMP水平，从而产生多种生理效应，包括利钠、利尿、血管舒张作用；还可抑制血管平滑肌细胞和成纤维细胞增殖等。但是，BNP分泌和清除的半衰期较短，分别约为2分钟和18分钟。蛇钠肽(DNP)是一种从蛇毒中提取的利钠肽，由38个氨基酸组成(图2)。由于在人和大鼠的血和组织中也可测得DNP的表达，提示DNP可能是另一类内源性利钠肽。同样，DNP也具有促进水钠排泄，诱导血管舒张和抑制血管平滑肌细胞增殖的功能。DNP的羧基末端(即C端)由15个氨基酸组成，可增加cGMP的刺激效应，其刺激心肌细胞产生cGMP的能力是 ANP 的 10 倍。NPRC (Natriuretic peptide C receptor, NPRC)是细胞表面的利钠肽清除受体，DNP与NPRC的亲和力低于ANP和BNP，对中性内肽酶有较强的抵抗力，提示DNP在循环中并不像其他利钠肽那样被快速清除。因此，DNP的半衰期较长。目前市场上已经有基于基因工程制备的BNP，其主要用于治疗急性心衰。但是，由于作用位点单一且半衰期短等原因，BNP对急性心衰的治疗效果还不够理想。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术中将脑钠肽应用于治疗急性心衰时，由于其作用位点特异性结合作用有限且药物半衰期短而造成的对急性心衰防治效果不理想的缺陷，提供一种基于基因工程技术制备的新型钠肽，这种新型钠肽同时具有脑钠肽及蛇钠肽的特性，特异性作用显著增强，药物半衰期显著延长，可有效作用于心脏、血管及肾脏等效应器官，并有效保护心脏、肾脏及其他器官的功能，达到保护、预防和治疗心脏、肾脏及其他器官衰竭疾病的目的。本专利技术要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现:提供一种基因工程新型钠肽，所述新型钠肽由脑钠肽和蛇钠肽连接组成；所述脑钠肽位于所述新型钠肽的N端，且所述蛇钠肽位于所述新型钠肽的C端；所述脑钠肽包括由两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构。在上述基因工程新型钠肽中，所述新型钠肽由41个氨基酸组成，其中位于N端的脑钠肽具有26个氨基酸，位于C端的蛇钠肽具有15个氨基酸。在上述基因工程新型钠肽中，所述脑钠肽为人脑钠肽且包括一个完整的人脑钠肽的环状功能区，所述蛇钠肽具有完整的蛇钠肽C端的15个氨基酸。在上述基因工程新型钠肽中，所述新型钠肽具有序列表中的SEQ ID No:7所示的氨基酸序列。根据本专利技术的另一方面，提供一种上述基因工程新型钠肽的制备方法，所述方法包括以下步骤:A:分别获取脑钠肽基因和蛇钠肽基因；`B:通过PCR方法将步骤A中的所述脑钠肽基因和蛇钠肽基因拼接合成新型钠肽基因；所述新型钠肽基因由位于其N端的所述脑钠肽基因和位于其C端的所述蛇钠肽基因连接组成；C:采用原核表达载体构建包括所述新型钠肽基因的表达质粒；以及D:将步骤C中形成的表达质粒转化至表达菌株中进行诱导培养，表达所述新型钠肽。在上述新型钠肽的制备方法中，获取的所述脑钠肽基因为人脑钠肽基因。在上述新型钠肽的制备方法中，所述步骤A包括以下子步骤:获取全长人脑钠肽基因；从所述全长人脑钠肽基因获取所述人脑钠肽基因的N末端基因片段:构建引物序列 3:5，-GAA TTC GTT CGT GGT CCG CGT AGC CCG AAG ATGGTG CAA-3，和引物序列 4:5’ -AGC GTT CGG ACG CGG GTC ACG CAG GCTCGG GCA GCC CAG GCC ACT GGA-3’:以及获取所述蛇钠肽基因的C末端基因片段:构建引物序列5:5’-GT GGA TCCTCA AGCGCT AGT GCT CGG AGC GTT CGG ACG CGG GTC ACG-3’。在上述新型钠肽的制备方法中，在所述步骤D之后，所述方法还包括步骤E:离心收集所述表达菌株的菌体，进行纯化后得到所述新型钠肽。在上述新型钠肽的制备方法中，在所述步骤C中，所述原核表达载体为PGEX-4T-1或pCW ;在所述步骤D中，所述表达菌株为DH5 a、BL21、Rosetta或Rosetta-gami。根据本专利技术的另一方面，提供一种上述基因工程新型钠肽在制备用于保护、预防及治疗心血管疾病和肾脏疾病的基因工程药物中的应用。实施本专利技术的技术方案，可以获得以下技术效果:BDNP具有由BNP构成的N端和由DNP构成的C端，构成N端的BNP与利钠肽受体A的结合能力强，同时DNP对中性内肽酶的酶解具有较强的抵抗力；特异性结合以及生物学作用的强度和作用时间显著增加，从而显著增加了 cGMP的刺激效应，实现双重增强利钠肽的生理、药理效能；本专利技术的新型钠肽能有效作用心脏、血管及肾脏等效应器官，并有效保护心脏及肾脏及其他器官的功能；本专利技术的制备方法工艺简单、切实可行；具有本专利技术的新型钠肽基因工程药物可有效作用于效应器官，达到预防和治疗心脏及肾脏及其他器官衰竭疾病的目的。本专利技术的新型钠肽基因工程药物还可以用于治疗急性呼吸窘迫综合症(ARDS)，以及高血压(包括妊娠高血压)、糖尿病、肥胖症等疾病。【附图说明】以下将结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。附图中:图1是人脑钠肽的示本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因工程新型钠肽，其特征在于，所述新型钠肽由脑钠肽和蛇钠肽连接组成；所述脑钠肽位于所述新型钠肽的N端，且所述蛇钠肽位于所述新型钠肽的C端；所述脑钠肽包括由两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构。
【技术特征摘要】
1.一种基因工程新型钠肽，其特征在于，所述新型钠肽由脑钠肽和蛇钠肽连接组成；所述脑钠肽位于所述新型钠肽的N端，且所述蛇钠肽位于所述新型钠肽的C端；所述脑钠肽包括由两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构。2.根据权利要求1所述的基因工程新型钠肽，其特征在于，所述新型钠肽由41个氨基酸组成，其中位于N端的脑钠肽具有26个氨基酸，位于C端的蛇钠肽具有15个氨基酸。3.根据权利要求1所述的基因工程新型钠肽，其特征在于，所述脑钠肽为人脑钠肽且包括一个完整的人脑钠肽的环状功能区，所述蛇钠肽具有完整的蛇钠肽C端的15个氨基酸。4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的基因工程新型钠肽，其特征在于，所述新型纳妝具有序列表中的SEQ ID No:7所不的氣基酸序列。5.一种权利要求1-4中任一权利要求的基因工程新型钠肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: A:分别获取脑钠肽基因和蛇钠肽基因； B:通过PCR方法将步骤A中的所述脑钠肽基因和蛇钠肽基因拼接合成新型钠肽基因；所述新型钠肽基因由位于其N端的所述脑钠肽基因和位于其C端的所述蛇钠肽基因连接组成； C:采用原核表达载体构建包括所述新型钠肽基因的表达质粒；以及 D:将步骤C中形成的表达质 粒转化至表达菌株中进行诱导培养，表达所述新型钠肽。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，获取的所述脑钠肽基...
【专利技术属性】
技术研发人员：李凌云，周兆平，王晓红，章刚，林枫，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：
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