本发明专利技术公开了一种检测重组猪干扰素α1冻干粉针剂中细菌内毒素含量的方法。采用改良鲎试剂检查法，用2ml细菌内毒素检查用水溶解重组猪干扰素α1冻干粉针剂，100℃煮沸10min去除鲎试验干扰因素，用细菌内毒素检查用水在不超过最大有效倍数的情况下对煮沸处理后重组猪干扰素α1蛋白进行逐级稀释，先检查各稀释浓度的细菌内毒素含量，然后再从反应结果为阴性的最低稀释度开始做干扰试验，找出在无干扰的情况下能与鲎试验形成凝胶的最低浓度，从而确定重组猪干扰素α1冻干粉针剂中内毒素的具体含量。本发明专利技术为重组猪干扰素α1冻干粉针剂生产应用提供了测定细菌内毒素的测定方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物领域，涉及一种生物制品的细菌内毒素含量检测方法，具体涉及一种重组猪干扰素α I冻干粉针剂中细菌内毒素含量的检测方法。
技术介绍
干扰素作为当前公认的抗病毒有效药物，安全性能好，并具有良好的抗病毒及免疫调节功能，是当今应用前景最为广泛的生物制剂之一。动物用干扰素最早应用于兽医临床的是猪白细胞干扰素，但该种干扰素表达量低，需采用生化分离的方法获得，成本较高，不利于规模化生产。我室采用基因工程技术获得了一种重组猪干扰素α(重组猪α干扰素的制备方法，专利号2008100201804)，临床试用结果表明其可有效治疗猪病毒性腹泻等疾病。细菌内毒素是一种革兰阴性细菌细胞壁的组成成分，只有在细菌死亡或繁殖时，才释放到细胞外，发挥各种效应。内毒素化学本质为脂多糖(LPS)。细菌内毒素检查法是近二十年来发展起来的用于检测药品及其中间品中内毒素污染的一种方法。传统的细菌内毒素检查法是家兔热原检查。2005年版《中国药典》参照美、欧、日三方关于细菌内毒素检查法协调案的格式，并结合国内实际情况，确定了鲎试验法做为检测人基因工程干扰素制剂细菌内毒素含量的标准检测方法。本法与传统家兔法比较具有灵敏度高，无个体差异，受外界影响小，实验重现性好，费用低廉等优点，非常适合厂家对生产全过程的热原监控和中间产品检测。但是目前兽用生物制品现行的细菌内毒素检查法依然是传统的家兔热原检查，因此建立兽用生物制品中新的细菌内毒素含量检测方法具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术目的就是提供一种重组猪干扰素α I冻干粉针剂中细菌内毒素含量的检测方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种检测重组猪干扰素α I冻干粉针剂中细菌内毒素含量的方法，采用改良鲎试剂检查法，包括以下步骤:用2ml细菌内毒素检查用水溶解重组猪干扰素α I冻干粉针剂，100°C煮沸IOmin去除鲎试验干扰因素，用细菌内毒素检查用水在不超过最大有效倍数的情况下对煮沸处理后重组猪干扰素α I蛋白进行逐级稀释，先检查各稀释浓度的细菌内毒素含量，然后再从反应结果为阴性的最低稀释度开始做干扰试验，找出在无干扰的情况下能与鲎试验形成凝胶的最低浓度，从而确定重组猪干扰素α I冻干粉针剂中内毒素的具体含量。本专利技术的优点是:可以快速地检测出重组猪干扰素α I冻干粉针剂中的细菌内毒素含量。采用加热法去除了干扰因素，检测结果准确可靠。操作简便，无需贵重精密的大型的设备，检测成本低。【具体实施方式】实施例11.试剂供试品:重组猪干扰素α I冻干粉针剂(批号是20121116，效价为1.0XlO6IU,内毒素含量为25EU)细菌内毒素检查用水:内毒素含量小于0.015EU/ml且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水细囷内毒素国豕标准品:购自中国食品药品检定研究院，每支10000EU。鲎试剂:购自厦门鲎试剂厂，0.1ml/支(λ=0.25EU/ml)2.仪器设备旋润混合器、封口膜、试管(IOX 75mm)、吸管、镊子(金属)、金属盒。实验中使用的所有玻璃器具一般经洗液浸泡后，取出用自来水、纯化水依次冲洗干净(可用纯化水浸泡)。试验中所用的器皿，需要经过250°C干烤30分钟以上备用，以除去外源性内毒素。除去外源性内毒素的玻璃器皿应在规定内使用(如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用)，否则须再次除去可能存在的外源性内毒素。3.确定细菌内毒素限值公式L=K/M计算。M为每公斤每小时临床最大用药剂量，依据药品使用说明书确定，注射时间若不足I小时，按I小时计算。K为每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以 EU/(kg.h)表示，注射剂 K=5EU/(kg.h)本室重组猪干扰素α I冻干粉针剂按效价计算:每公斤每小时临床最大用重组猪干扰素α I冻干粉针剂剂量1000IU (20公斤乳猪20000IU干扰素)，L为5EU/2000IU=0.0025EU/IU，每支重组猪干扰素α冻干成品20000IU，则每支重组猪干扰素α I冻干粉针剂内毒素限值为50EU。4.确定最大有效稀释倍数(MVD)最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数(MVD)，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD:MVD=cL/ λ其中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。本室重组猪干扰素α I冻干粉针剂:c=10000IU/ml，L为0.0025EU/IU，λ为0.25EU/ml, MVD=IOO。5.鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml标示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ )，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在镟涡混合器上混匀15分钟,然后制成2 λ、λ、0.5 λ和0.25 λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步应在漩涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml當试剂溶液的IOmmX 75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的當试剂原安瓿18支,其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37°C ±1°C的恒温器中，保温60分钟±2分钟。当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λ C)。λ C=Ig-1 (Σ Χ/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。需要注意的是，当实测灵敏度入。在0.5入?2.0λ (包括0.5入?2.0λ，λ为鲎试剂灵敏的标示值)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度(结果见表I)。6.干扰试验预试验取一支重组猪干扰素α I冻干粉针剂，然后用2ml细菌内毒素检查用水溶解后作为原液。按照拟定内毒素限值，加内毒素检查用水溶解并稀释至不超过MVD规定的系列稀释度:1:10、1:20、1:40、1:80、1:100，再分别将每个稀释度制成含有和不含有2 λ细菌内毒素标准品的重组猪干扰素αI溶液。同时设立阳性对照(加入2λ的标准内毒素)及阴性对照(细菌内毒素检查用水)，其中每个稀释度平行做两支，计算平均回收率。重组猪干扰素α I原液1:20、1:40、1:80、1:100稀释外加2 λ细菌内毒素标准品后，细菌内毒素检测回收率均在有效范围50%?200%内，表明重组猪干扰素α I冻干粉针剂在该实验条件下已能排除干扰因素。正式干扰实验选用1:20稀释度。7.干扰试验重组猪干扰素α I原液1:20稀释，按表2制备各系列溶液。参照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，记录供试液的干扰情况。结果观察与判断:只有当重组猪干扰素α I溶液(A)和阴性对照溶液(D)的平行管都为阴性，且鲎试剂标示灵敏度的对照本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测重组猪干扰素α1冻干粉针剂中细菌内毒素含量的方法，其特征在于采用改良鲎试剂检查法，包括以下步骤：用2ml细菌内毒素检查用水溶解重组猪干扰素α1冻干粉针剂，100℃煮沸10?min去除鲎试验干扰因素，用细菌内毒素检查用水在不超过最大有效倍数的情况下对煮沸处理后重组猪干扰素α1蛋白进行逐级稀释，先检查各稀释浓度的细菌内毒素含量，然后再从反应结果为阴性的最低稀释度开始做干扰试验，找出在无干扰的情况下能与鲎试验形成凝胶的最低浓度，从而确定重组猪干扰素α1冻干粉针剂中内毒素的具体含量。
【技术特征摘要】
1.一种检测重组猪干扰素α I冻干粉针剂中细菌内毒素含量的方法，其特征在于采用改良鲎试剂检查法，包括以下步骤: 用2ml细菌内毒素检查用水溶解重组猪干扰素α I冻干粉针剂，100°C煮沸10 min去除鲎试验干扰因素，用细菌内毒素检查用水在不超过最大...
【专利技术属性】
技术研发人员：王明丽，赵俊，叶靓，周炜，
申请(专利权)人：王明丽，赵俊，
类型：发明
国别省市：
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