本发明专利技术涉及使用细菌毒素衍生的转运序列递送生物活性剂的系统和方法。本发明专利技术提供了霍乱弧菌Cholix基因的一种无毒突变体形式(ntCholix)、一种在氨基酸A386处截短的Cholix变体(Cholix386)、以及其他不同的Cholix衍生的多肽序列用来增强生物活性药物、治疗剂的肠递送的用途。在此所述的这些系统和方法提供了以下项：在没有注射的情况下递送大分子剂量的能力；将负荷例如(但不限于)siRNA或反义分子递送至其中需要它们的活性的细胞内区室中的能力；以及使基于纳米颗粒和树枝状化合物的载体的穿过生物膜的递送，要不然该递送会由于大多数这种膜的屏障特性而将会受到阻碍。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】[00011 本申请是申请日为2011年9月15日，申请号为201180053563.1，专利技术名称为"使用 细菌毒素衍生的转运序列递送生物活性剂的系统和方法"的申请的分案申请。 相关专利申请 本申请要求2010年9月15日提交的美国临时申请号61/403,394的权益，通过引用 以其全文结合在此。
本专利技术的领域部分涉及用于新颖的药物应用的策略。更确切地说，本专利技术涉及霍 乱弧菌(Vibrio cholera)ChoIix基因的一种无毒突变体形式(ntCholix)、一种在氨基酸 A386处截短的Cholix变体(Cholix386)、以及其他不同的Cholix衍生的多肽序列用来增强生 物活性治疗剂的肠递送的用途。重要的是，在此所述的这些系统和方法提供了以下项:在没 有注射的情况下递送大分子剂量的能力;将负荷例如(但不限于）siRNA或反义分子递送至 其中需要它们的活性的细胞内区室中的能力；以及基于纳米颗粒和树枝状化合物的载体穿 过生物膜的递送，要不然该递送会由于大多数这种膜的屏障特性而将会受到阻碍。
技术介绍
大多数当前批准的小分子药物是穿过小肠粘膜而被吸收的，以便提供到体循环的 递送。事实上，小分子药物是基于它们穿过肠粘膜的稳定性和有效吸收而被选择。生物活性 多肽(指的是由氨基酸残基组成的聚合物，典型地定义为一种蛋白质或肽)的相似的口服递 送已经成为制药工业中的一个长期目标。因为胃肠(GI)道的目的是为了消化膳食蛋白质类 和肽类，存在着很多物理学、生理学、以及生物学屏障，这些屏障限制了以一种类似于用小 分子可完成的方式从肠摄取治疗性蛋白质和肽的可行性；马哈图(Mahato，R.I.)等人，《治 疗性药物载体系统评论》（Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，20(2_3):p. 153-214 (2003))〇 已经鉴定了能够用来保护治疗性蛋白质和多肽通过胃的许多技术，允许它们到达 小肠中的上皮细胞的吸收表面并且将它们与发挥破坏膳食蛋白质类和肽类的作用的胃肠 环境分开。遗憾的是，然而由于在内腔表面的多肽的内涵体摄取之后通向破坏性溶酶体区 室的细胞内运输，穿过这种简单的、单层细胞的有效转运仍然是一个实质性屏障；伍德利 (Woodley,J.F·)，《治疗性药物载体系统评论》(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 11(2- 3) :p.61-95(1994))。的确，这种屏障的目的是为了抑制蛋白质类和肽类的摄取，直到这些 大分子可以充分地被降解以便通过氨基酸以及二肽或三肽转运蛋白而吸收。在此方面，已 经检验了克服肠粘膜的物理学、生理学、以及生物学屏障的多种努力。 有两种穿过构成肠粘膜细胞屏障的单层上皮的基本途径。确切地说，一旦穿过覆 盖的粘液层，分子可以经由在内部运输细胞质内容物的、但不混合的一系列囊泡而在邻近 的上皮细胞之间移动(细胞旁路途径)或穿过细胞移动(跨细胞途径）；T. Jung等人，《欧洲制 药学与生物制药学杂志》(Eur J Pharm Biopharm,50:147-160(2000))。换言之，在两种途 径中，转运蛋白质或肽治疗剂不进入细胞而是停留在细胞的细胞质之外的环境中。 治疗性蛋白质和肽通过细胞旁路途经的随机移动的主要屏障是在这些细胞的顶 颈部(apical neck)处的、称为紧密连接(TJ)的蛋白质复合物。虽然TJ结构的瞬时打开和关 闭可以促进转运肽穿过肠上皮，这种途径具有以下关键局限性:例如，它对于在约5kDa以上 的分子并非有效;它具有使物质从肠内腔非选择性地进入体内的潜力;并且它代表涉及肠 上皮表面区域的的仅仅一小部分的途径。 蛋白质或肽治疗剂经由跨细胞途径穿过细胞而随机迀移的主要屏障是缺乏囊泡 运输，这种运输将这些囊泡的内容物递送至破坏性的（溶酶体的）路径中。当与细胞旁途径 相比较时，通过囊泡跨细胞途径的移动可以接纳直径大至IOOnm的物质，基本上涉及整个上 皮细胞表面，并且在通过使用用于囊泡进入的受体-配体互相作用的物质摄取中可以是高 度选择性的。因此，对于蛋白质或肽治疗剂的上皮转运而言，如果可以避免破坏性的路径， 则跨细胞途径是非常吸引人的。 一些病原体已经解决了运输屏障问题，如通过分泌的多肽毒力因子(这些毒力因 子起到促进和/或稳定宿主感染的作用）的有效转胞吞作用所证明的。外毒素表示一类由许 多种微生物释放的蛋白质，它作为有力的毒力因子起作用。外毒素在多细胞生物上发挥作 用，具有充当在人类中的有力毒素的能力；罗斯扎克（Roszak，D.B.)，以及科尔威尔 (Colwell，R.R·)，《微生物综述》(Microbiol Rev 51: 365-379(1987))。这些蛋白质通常通 过涉及选择性破坏蛋白质合成的机制而杀死或灭活宿主细胞。因此，仅需要少数分子来杀 死细胞，与细菌外毒素是已知的最毒的毒剂中的一些的观察相一致。包括由来自白喉棒状 杆菌(Corynebacterium diphtheria)的白喉毒素(DT)、来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素 A(PE)、以及来自霍乱弧菌（Vibrio cholera)的最近鉴定的称为 Cho I ix的蛋白质组成的蛋白质家族的这些蛋白质的亚组经由延伸因子2 (EF2)的ADP-核糖 基化而起到使宿主细胞中毒的作用；耶茨(Yates，S.P.)等人，《生物化学科学动态》(Trends Biochem Sci，31:123-133(2006))。这些外毒素被合成为折叠成相异的结构域的氨基酸单 链，这些结构域已经被鉴定为具有在靶向、进入宿主细胞、以及使宿主细胞中毒方面的特殊 功能。 最近已经描述了来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素 A(PE)的 生物学;Mrsny,R.J.，等人，《当代药物发现》（Drug Discov Today，7(4) :ρ·247-58(2002))。 PE是由613个氨基酸单链组成的，具有66828. IlDa的理论分子量(MW)、5.28的等电点（PI)， 并且它功能性地折叠成三个离散结构域，表示为结构域KAla1-Glu 252 K结构域IKGly253-Asn364)、结构域III (Gly4t35-Lys613，它包含ADP核糖基转移酶活性位点），以及连接结构域II 和结构域III的一个短的二硫键连接的环(该环称为Ib环）(Ala365-Gly4t34)。已经根据分辨率 约O A的晶体衍射确定了这些结构域在pH 8.0时的结构；卫德肯(Wedekind, J.E.)，等 人，《分子生物学杂志》(J Mol Biol ,314:823-837(2001))。结构域I(Ia+Ib)具有一个从13-股卷（13-stranded β-ro11)形成的核心，结构域II是由六个α-螺旋组成的，并且结构域 ΙΠ 具有复合的α/β-折叠结构。研究已经支持PE的模块性质允许不同的结构域功能的观点， 这些不同的结构域功能如下：结构域I结合至宿主细胞受体，结构域II涉及膜转位，并且结 构域III作为ADP核糖基转移酶起作用。显示PE可能是响应于本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的递送构建体，该分离的递送构建体包括修饰的Cholix毒素，所述修饰的Cholix毒素包括1)氨基酸残基Val1‑Lys265并2)在不是Ala386或Glu581的氨基酸残基处被截短或突变；和与所述修饰的Cholix毒素偶联的治疗性负荷，所述分离的递送构建体能够递送所述治疗性负荷。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：兰德尔·J·米斯尼，塔希尔·玛穆德，
申请(专利权)人：兰德尔·J·米斯尼，塔希尔·玛穆德，
类型：发明
国别省市：美国;US
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