本发明专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种人源S‑腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用，通过制备一种人源S‑腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)，利用该人源S‑腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)来筛选SAHH抑制剂，所得到的抑制剂可以用于去制备一种新型的治疗阿尔兹海默症的药物。包括以下步骤：提供编码人源的sahh基因序列；构建pPIC9K‑sahh重组质粒；将重组质粒pPIC9K–sahh转化到大肠杆菌载体；提取pPIC9K–sahh质粒，酶切处理，转化整合到毕赤酵母GS115基因组；诱导毕赤酵母表达人源SAHH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，纯化，制备的水解酶具有高产量、高纯度，以及更高的活性，更好的稳定性，并筛选得到一种新型抑制剂4‑(3‑Hydroxyprop‑1‑en‑1‑yl)‑2‑methoxyphenol(CAS:458‑35‑5，ZINC：12359045)，从而用于制备治疗阿兹海默症的药物。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及生物工程和生化制药领域，具体涉及一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用，通过制备一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)，利用该人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)来筛选SAHH抑制剂，所得到的抑制剂可以用于去制备一种新型的治疗阿尔兹海默症的药物。
技术介绍
：同型高半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是蛋氨酸代谢过程中的重要中间产物。血液中Hcy含量的异常升高会引起同型高半胱氨酸血症。阿尔兹海默病(AD)是一种神经系统退行性疾病，其病理特征主要表现为老年斑(SP)和神经原纤维缠结(NFT)。老年人口血浆Hcy的稳定提高是AD的潜在危险因子。Hcy水平升高，引起氧化应激反应，降低抗氧化反应能力，导致神经细胞功能障碍；Hcy水平升高损害DNA修复机制，诱导细胞凋亡。基于AD患者Hcy异常升高的原因，而人体内Hcy的生成是由SAHH催化SAH可逆水解生成Ado和Hcy。通过抑制SAHH的活性来降低Hcy的浓度，因此我们可以筛选人源SAHH的抑制剂，从而用于制备治疗AD的药物。目前，国内外把检测Hcy的含量作为诊断是否患有同型高半胱氨酸血症的一个重要指标。Hcy的检测方法主要有四种:免疫学检测、色谱检测、同位素检测法和酶法。其中免疫学检测自动化程度高，适合大多数临床实验室应用；同位素检测法操作繁琐且有放射污染，虽然经过改良也未能推广使用；酶法与HPLC法相关性良好，无需样本预处理，正被广泛的使用。酶法中，涉及到的最重要的酶中就包括SAHH。通用甲基供体：S-腺苷甲硫氨酸(S-AdenosyLmethionine，AdoMet，SAM)受甲基转移酶催化去甲基后，生成的通用产物是S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyLhomocystein，SAH)，SAHH催化SAH可逆水解生成Ado和Hcy，形成的Hcy可以循环的加入反应，从而放大检测信号。这些反应可以用来研发同型高半胱氨酸检测试剂盒。目前，基因重组的方法制备SAHH已屡见不鲜，但是针对人源sahh基因在酵母菌表达系统还没有出现。我们通过制备人源的SAHH来筛选抑制剂，筛选到的抑制剂可以用来制备治疗人类的阿尔兹海默症的药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于筛选一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用。通过提供一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的制备方法，来制备高纯度，高活性的人源的SAHH，然后以此酶为基础来筛选SAHH抑制剂，以至可以将筛选到的SAHH抑制剂用于制备治疗人类的阿尔兹海默症的药物。本研究课题受国家自然科学基金面上项目：31370090，国家自然科学基金青年基金项目：21507040，山东省重点研发计划，2015GSF121006山东省自然科学基金：BS2015SWSW023资助。为实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种人源SAHH的制备方法，包括以下步骤：(1)提供编码人源的sahh基因序列，该基因的序列如SEQIDNO.1所示；(2)构建pPIC9K-sahh重组质粒；(3)将重组质粒pPIC9K–sahh转化到大肠杆菌载体；(4)提取pPIC9K–sahh质粒，酶切处理，转化整合到毕赤酵母GS115基因组；(5)诱导毕赤酵母表达人源SAHH，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，纯化。优选地，sahh基因是全基因合成。全基因合成的引物为：上游引物5’AOX：GACTGGTTCCAATTGACAAGC，其基因序列如SEQIDNO.3所示；下游引物3’AOX：GGCAAATGGCATTCTGACATCCT，其基因序列如SEQIDNO.4所示。优选地，所述步骤(5)中诱导毕赤酵母表达人源SAHH的发酵条件为：发酵温度为22℃，pH为6.0-7.0，连续发酵4天以上，优选为4-6天。诱导时加入甲醇，终浓度为总培养基体积的0.1％-0.4％。当加入的甲醇的量大于0.5％时，其蛋白浓度会降低2％-10％，酶活会降低1％-5％。本专利技术提供该水解酶的应用，人源SAHH能可逆性地催化S-腺苷高半胱氨酸(SAH)分解为腺苷(Ado)、高半胱氨酸(Hcy),SAH的分子结构如图7所示，根据竞争性抑制剂的结构特征，我们通过ChemMapper寻找SAH底物腺苷类似物，然后通过ZINC和SciFinder进行初步筛序，从338种小分子化合物中筛选到20种SAH底物腺苷类似物，最后通过将所筛选到的这20种SAH底物腺苷类似物抑制剂加入SAHH和SAH的混合体系中，通过用Ellman试剂和酶标仪在紫外412nm下检测Hcy的吸光度来计算酶活的大小，通过分析酶活的降低比例来筛选抑制率高、无细胞毒性的SAHH抑制剂。具体的筛选步骤为：所述的人源SAHH筛选抑制剂的方法为：将SAH底物腺苷类似物抑制剂加入SAHH酶中，通过用Ellman试剂和酶标仪在紫外412nm下检测Hcy的吸光度来计算酶活的大小，分析酶活的降低比例，再进行细胞毒性试验来筛选抑制率高、无细胞毒性的SAHH抑制剂。经过筛选，得到了一种新型的SAHH抑制剂—4-(3-Hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol,其结构式如图8，其功能为可以抑制人源SAHH的活性，从而可以应用到制备治疗阿兹海默症药物中。所述的抑制剂与SAHH酶的物质的量的比为1:500。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益成果：1.通过全基因组合成技术获得的人源sahh基因，同时进行了高通量测序，通过Blast比对，与人源的相似度为百分之百。sahh基因表达的蛋白是合成新型抗生素药物的一个必要环节，为提高安全性，不能用其他物种的基因表达的蛋白替代。2.诱导表达sahh基因时，发酵的温度对生成的酶的活性和浓度至关重要，温度为22℃时，酶的活性最高，表达量也显著提高。3.本专利技术采用毕赤酵母来表达蛋白，因毕赤酵母是真菌，有细胞器可以对合成的蛋白进行后期的折叠和甲基化修饰。4.4-(3-Hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol，是一种新型的抑制剂，其IC50＝36nM，抑制率相对较高。5.将毕赤酵母表达系统优化后可得高活性、高浓度、高稳定性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶，并且成本低，实验周期短，完全可以用于大规模的生产，从而可以降低检测心血管疾病的同型高半胱氨酸检测试剂盒的成本。6.本专利技术的制备方法，通过优化各个步骤、参数、所用试剂等一系列改变，提供了一种高效的制备方法，成本低，实验周期短，制备的水解酶具有高产量、高纯度，以及更高的活性，更好的稳定性，为后续应用提供了非常有利的条件。本研究课题受国家自然科学基金面上项目：31370090，国家自然科学基金青年基金项目：21507040，山东省重点研发计划，2015GSF121006山东省自然科学基金：BS2015SWSW023资助。附图说明图1：pPIC9K-sahhNotI和EcoRI双酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳图；图2：pPIC9K-sahh和pPIC9K质粒线性化后1％琼脂糖凝胶电泳图；图3：1.5mg/mLG418的YPD固体平板上菌体PCR后琼脂糖电泳图；图4：10％SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化SAHH；图5：酶活标本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人源S‑腺苷高半胱氨酸水解酶SAHH的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提供编码人源的sahh基因序列，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示；(2)构建pPIC9K‑sahh重组质粒；(3)将重组质粒pPIC9K–sahh转化到大肠杆菌载体；(4)提取pPIC9K–sahh质粒，酶切处理，转化整合到毕赤酵母GS115基因组；(5)诱导毕赤酵母表达人源SAHH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，纯化；sahh基因是全基因合成。
【技术特征摘要】
1.一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶SAHH的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提供编码人源的sahh基因序列，该基因的序列如SEQIDNO.1所示；(2)构建pPIC9K-sahh重组质粒；(3)将重组质粒pPIC9K–sahh转化到大肠杆菌载体；(4)提取pPIC9K–sahh质粒，酶切处理，转化整合到毕赤酵母GS115基因组；(5)诱导毕赤酵母表达人源SAHH，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，纯化；sahh基因是全基因合成。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)构建pPIC9K-sahh重组质粒，包括以下操作：2.1sahh全基因合成，2.2连接pPic9k-sahh，2.3BL21感受态细胞的制备，2.4表达载体转化，2.5阳性重组子的鉴定。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)提供编码人源的sahh基因序列，该基因的序列如SEQIDNO.1所示；(2)构建pPIC9K-sahh重组质粒；其中，2.1sahh全基因合成步骤，全基因合成时考虑到后期纯化的需要，在DNA链末端插入了6个组氨酸标签，通过全基因合成技术合成拥有完整编码框的sahh基因：该基因的序列如SEQIDNO.1所示；(3)将重组质粒pPIC9K–sahh转化到大肠杆菌载体；(4)提取pPIC9K–sahh质粒，酶切处理，转化整合到毕赤酵母GS115基因组；通过电转化将其含有目的基因的片段整合到毕赤酵母GS115基因组中涂MD平板28℃培养2-3d，用0.25mg/mL遗传霉素G418YPD液体培养基筛选阳性菌株；(5)诱导毕...
【专利技术属性】
技术研发人员：谷劲松，李艳华，单秋丽，韩甜，贺盛，郝委委，谭晓军，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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