一种源于嗜热古菌的多糖水解酶基因及应用属生物工程和酶工程技术领域，本发明专利技术公开的多糖水解酶基因Tk1765的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；多糖水解酶基因Tk1765的编码序列如SEQ ID NO：2所示；该多糖水解酶具有高效率的水解羧甲基纤维素和甲壳糖的双酶切特性；该多糖水解酶水解羧甲基纤维素最适pH值为10.0，最适酶反应温度为65℃；水解甲壳糖最适pH值为11.0，最适酶反应温度为80℃；该酶在温度100℃加热4h，酶活性能保持40％以上。通过构建该酶的重组载体并在毕赤酵母中超量表达，其产物具有水解玉米秸秆的功能，本发明专利技术的多糖水解酶酶及其编码基因可广泛应用于纤维素和几丁质降解。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物工程和酶工程
，具体涉及一种多糖水解酶及其编码基因、含有编码基因的重组载体、基因工程菌株以及其生物学活性和应用。
技术介绍
在古细菌的热稳定酶中，碳水化合物代谢相关酶类已受到广泛关注，这些酶主要包括纤维素酶、淀粉酶、几丁质酶和一些糖苷转移酶类。在淀粉加工中，淀粉的液化需要在高温下进行。目前工业生产中使用的淀粉酶主要是由中温型芽孢杆菌及其突变体产生的，其最适反应温度为90-95℃，而来源于Pyrococcuswoesei的极端热稳定淀粉酶可在130℃催化，在120℃加热5个小时后仍有活性。嗜热古细菌的淀粉酶除了具有在高温下有催化活性的优点外，其催化底物还具有广谱性，例如Pyrococcusfuriosus中的淀粉酶可以降解淀粉生成麦芽三糖和麦芽四糖，同时还可以催化普鲁兰和β环状糊精的水解。同时，嗜热古细菌中还含有其他淀粉降解相关酶，比如葡萄糖苷酶、普鲁兰酶和环状糊精酶。这种酶的多样性和同一种酶底物的多样性意味着嗜热菌中淀粉降解相关酶可在淀粉的转化如糖化、液化和异构化中具有巨大的应用潜力。由纤维素到生物能源的转化是当今研究的热点之一。据预测，此项技术有望在未来7-12年实现，而纤维素酶在其转化中具有重要作用。秸秆等农业废弃物是环境污染的来源之一，农作物秸秆的主要成分是纤维素，纤维素酶作为分解纤维素的一种水解酶可将农作物秸秆分解成可溶于水的碳水化合物，生产绿色生物能源。纤维素酶水解纤维素是在β-1,4-内切葡聚糖酶(EG,Endo-β-Glucanase)、β-1,4-外切葡聚糖酶(CBH,Cellobiohydrolase)和β-葡萄糖苷酶(BG,β-Glucosidase)协同作用下进行的。但是由于纤维素不溶于水并形成结晶，使其难于降解，因此纤维素酶的低效率导致纤维素酶的成本成为利用秸杆等纤维质资源生产清洁燃料的最关键问题。由于古细菌生长的极端环境，嗜热古细菌中的纤维素降解酶正得到深入和广泛的研究。P.furiosus中内切葡聚糖酶可以有效地降解β-1,4糖苷键连接的葡聚糖和纤维素。2005年，Kashima报道了P.horikoshii中的一种内切葡聚糖酶可直接降解结晶纤维素。而P.furiosus中的β-葡萄糖苷酶和P.horikoshii中的β-1,4-内切葡聚糖酶组成的混合溶液，可以将微晶粉末纤维素彻底降解为葡萄糖。在其他的古细菌中，如Sulfolobussolfataricus,Thermotogamaritima也发现了可以降解纤维素的酶。由此可以看出对古细菌中纤维素酶的研究不仅是当前研究的热点和难点问题之一，同时研究成果亦可迅速转化为生产力。本专利技术涉及的嗜热古菌保藏于吉林省农产品深加工省重点实验室。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酶活力高和稳定性强的多糖水解酶，及其编码基因、重组载体、基因工程菌株及其应用。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术从极端嗜热厌氧古菌ThermococcuskodakarensisKOD1中获得一种多糖水解酶基因的全长DNA，命名为Tk1765，分类命名：巴斯德毕赤酵母--Pichiapastoris；保藏编号：CGMCCN0.13153；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年10月26日。该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，该基因序列长度为3648bp，编码1215个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现其含有5个结构域，其中有3个CBD结构域和2个β-1,4糖苷键水解结构域。构建含有多糖水解酶基因Tk1765序列的重组表达质粒载体pPIC9K-CCHA333(实施例1-2)，利用电转仪进行电击转化PichiapastoriSGs115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母重组工程菌株GS115-pPIC9K-Tk1765。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃、200rpm/min摇床培养2d后，以5:1比例浓缩转接于BMMY培养基中，在25℃、200rpm/min摇床培养诱导表达2d后，多糖水解酶产量达0.25mg/ml(实施例3)，该酶具有高效水解羧甲基纤维素和甲壳糖的双酶切酶活特性。该本专利技术的多糖水解酶水解羧甲基纤维素和甲壳糖实验中(实施例4)，水解羧甲基纤维素最适pH值为10.0，最适酶反应温度为65℃；水解甲壳糖最适pH值为11.0，最适酶反应温度为80℃；该酶在温度100℃加热4h，酶活性能保持40％以上，具有较高的热稳定性。在分解玉米秸秆的试验中(实施例5)，每1g玉米秸秆粉可产生0.2g葡萄糖。通过构建重组载体并在毕赤酵母中超量表达的产物具有高效的水解纤维素、几丁质和玉米秸秆的功能，本专利技术的多糖水解酶及其编码基因在纤维素降解和几丁质中可广泛应用。附图说明图1为多糖水解酶表达与纯化SDS-PAGE凝胶电泳图图2为多糖水解酶水解不同多糖底物效率结果示意图图3为多糖水解酶水解羧甲基纤维素的最适pH值测定结果示意图图4为多糖水解酶水解羧甲基纤维素的最适温度测定结果示意图图5为多糖水解酶水解羧甲基纤维素热稳定性的测定结果示意图图6为多糖水解酶水解甲壳糖的最适pH值测定结果示意图图7为多糖水解酶水解甲壳糖的最适温度测定结果示意图图8为多糖水解酶分解甲壳糖热稳定性的测定结果示意图图9为多糖水解酶水解玉米秸秆葡萄糖产率结果示意图具体实施方式实施例1：极端嗜热厌氧古菌T.kodakarensisKOD1基因组DNA提取培养适量的嗜热古菌T.kodakarensisKOD1，4000rpm离心10min收集菌体，用WashingTE(50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0)洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10％SDS，轻轻混匀后50℃放置3h～5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70％乙醇洗2次，干燥后溶于25μLddH2O中。实施例2:多糖水解酶基因Tk1765的克隆与表达载体的构建(1)引物设计：根据多糖水解酶基因同源序列的保守区，结合所用载体设计引物，在引物的5’端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点(下划线部分):上游引物：5’-CCGGAATTCGTGAAGAAGATTTGG(SEQIDNO：3)下游引物：5’-TTGCGGCCGCAATCAAACTGGAACTGCAACTG(SEQIDNO：4)(2)PCR扩增：以极端嗜热厌氧古菌T.kodakarensisKOD1基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系(25μL)如下：10×ExTagBuffer2.5μL，2.5mmol/L的dNTPsmixture1μL，10μmol/L的上下游引物各1μL，ExTagDNA扩增酶0.5μL，模板10-100ng，无菌去离子水18μL。PCR扩增条件：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多糖水解酶基因Tk1765，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种多糖水解酶基因Tk1765，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.按权利要求1所述的多糖水解酶基因Tk1765，其特征在于所述多糖水解酶基因Tk1765编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种重组载体以及重组载体转化得到的重组基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：张世宏，李正群，魏毅，陈丽娜，张鑫生，宋妍悦，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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