利用人参皂苷糖苷酶的次要人参皂苷的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种利用来自微杆菌属(Microbacterium testaceum)微生物的人参皂苷糖苷酶(Ginsenoside glycosidase)蛋白的次要人参皂苷的制备方法及包含所述蛋白的次要人参皂苷的转化用组合物，所述人参皂苷糖苷酶具有特异性地水解人参皂苷的第6个碳的糖而将人参皂苷转化成容易被人体吸收的形态即次要人参皂苷的非常优异的活性，因此可有效使用于人参皂苷的量产。

Method for preparing secondary ginsenoside using ginsenoside glycosidase

The invention relates to a method for using from Microbacterium (Microbacterium testaceum) ginsenoside glyosidase microorganism (Ginsenoside glycosidase) composition transformation method for preparation of protein secondary and secondary ginsenoside ginsenoside containing the protein, the ginsenoside glycosidase is specific hydrolysis of ginsenoside sixth carbon sugar and ginsenoside into an easily absorbed form of minor ginsenosides very excellent activity, so it can be effectively used in the production of ginsenosides.

【技术实现步骤摘要】
利用人参皂苷糖苷酶的次要人参皂苷的制备方法
本专利技术涉及一种利用来自微杆菌属(Microbacteriumsp.)微生物的人参皂苷糖苷酶(Ginsenosideglycosidase)蛋白的次要人参皂苷的制备方法及包含所述蛋白的次要人参皂苷的转化用组合物。
技术介绍
皂苷是指在广泛存在于植物的配糖体中，非糖部分由多种环状化合物构成的物质。作为主要生理活性成分而包含在人参或红参的皂苷成分即三萜皂苷(triterpenesaponin)的化学结构与在其他植物中发现的皂苷不同，因此为了区分这些人参皂苷与其他植物的皂苷，以人参(Ginseng)配糖体(Glycoside)的含义称为人参皂苷(Ginsenoside)。人参皂苷根据苷元(aglycone)的结构而可分为原人参二醇类(Protopanaxadiol-type，PPD型)人参皂苷、原人参三醇类(Protopanaxatriol-type，PPT型)人参皂苷、及齐墩果酸类(Oleanolicacid型)人参皂苷。这三种人参皂苷再次根据通过糖苷键(glycosidicbond)键合到化合物结构中的环的第3个碳、第6个碳及第20个碳的位置的糖部位(苷元(aglycones)、糖部分(sugarmoieties))的位置及数量而分类。PPD型人参皂苷包含Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、绞股蓝皂苷(gypenoside，Gyp)XVII、Compound0、CompoundMc1、F2、CompoundY、CompoundMC、Rg3、Rh2及C-K等。PPD型人参皂苷包含Re、Rg1、Rf、Rg2、Rh1及F1等。另外，占干参中的人参皂苷的90％以上的是主要人参皂苷，但因所述主要人参皂苷的质量接近1000道尔顿而在生物体内的吸产率非常低(Park，J.H.，FoodInd.Nutr.，2004，9：23-27)。因此，为了增大人参皂苷的药效，需要进行将主要人参皂苷转化为吸产率相对较高且药效也更突出的次要人参皂苷的过程(Akao，Kidaetal.1998，Tawab，Bahretal.2003)。即，主要人参皂苷为了在体内(invivo)有效地表现出生理活性，需要进行去除构成糖的葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等的转化过程(deglycosylated)。主要人参皂苷包含Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc及Rd等，微量的次要人参皂苷(稀有人参皂苷)包含F2、Rg3、Rh1、Rh2、绞股蓝皂苷(gypenoside，Gyp)XVII、绞股蓝皂苷LXXV、CompoundK、C-K、CompoundMc及CompoundMc1等。已知稀有人参皂苷F1具有抗老化及抗氧化功效，且已报告具有保护HaCaT角质细胞不会因UVB(UltravioletB，紫外线B)而细胞凋亡(apoptosis)效果(Lee，Choetal.2003)，具有皮肤美白功效及抗癌活性(Han，Leeetal.2014，Kim，Baeketal.2015)。然而，虽然人参皂苷F1具有这些优点，但从1976年被发现之后最近才报告其药理学活性。其原因在于，人参皂苷F1少量存在于人参叶，故而难以获得足够的量用于测定人参皂苷F1的生物学活性。作为用于生产微量存在于人参的次要人参皂苷F1的方法，提出有化学分解方法、酵素法及利用配糖体合成方法等，但如上所述的方法存在以下问题而在量产中存在极限：1)在制备工序上需经过多个步骤；2)在制备过程中目标成分消失；3)使用不适于食用的催化剂；或4)产率低。尤其，在酵素法中，对利用从多种微生物获得的助酵素、或微生物的主要人参皂苷的生物转化(biotransformation)进行较多的研究。然而，这些方法也无法有效地用作量产方法，具有产生较多费用的问题。至今为止已报告的F1生产方法是利用糖苷酶(glycosidase)通过生物学方法从0.5g的PPD型混合物生产数百mg的F1、Rh1、Rg2及Rg1、或利用从真菌类分离的β-糖苷酶从Rg1生产F1。另外，作为大量制备人参皂苷F1的最近的技术，报告有成功地利用来自地杆菌属(Terrabactersp.)微生物的β-糖苷酶(β-glucosidase)以克为单位量产F1的案例(注册专利10-1340079)。由此，本专利技术人等为了开发一种用于获取呈微量存在于人参等植物的形态的次要人参皂苷的方法而进行锐意努力，结果确认到如下情形而完成了本专利技术：与来自地杆菌属的β-糖苷酶相比，来自微杆菌属(Microbacteriumsp.)菌株的人参皂苷糖苷酶MT619可非常优异地将主要形态的人参皂苷生物转化成次要形态的人参皂苷。
技术实现思路
[专利技术要解决的问题]本专利技术的目的在于提供一种次要人参皂苷的制备方法，其包含如下步骤：利用选自由人参皂苷糖苷酶(ginsenosideglycosidase)蛋白、导入有包含对所述蛋白进行编码的核酸的载体的形质转化体、及所述形质转化体培养物构成的群组中的一种以上特异性地水解人参皂苷的第6个碳的糖而转化成去糖基化形态的步骤。本专利技术的另一目的在于提供一种次要人参皂苷的转化用组合物，其包含如下步骤：利用选自由人参皂苷糖苷酶(ginsenosideglycosidase)蛋白、导入有包含对所述蛋白进行编码的核酸的载体的形质转化体、及所述形质转化体培养物构成的群组中的一种以上特异性地水解人参皂苷的第6个碳的糖而转化成去糖基化形态的步骤。本专利技术的又一目的在于提供一种人参皂苷糖苷酶(Ginsenosideglycosidase)蛋白。本专利技术的又一目的在于提供一种对所述蛋白进行编码的核酸、包含所述核酸的载体及导入有所述载体的形质转化体。[解决问题的方法]用于达成所述目的的本专利技术的一实施方式提供一种次要人参皂苷的制备方法，其包含如下步骤：利用选自由人参皂苷糖苷酶(ginsenosideglycosidase)蛋白、导入有包含对所述蛋白进行编码的核酸的载体的形质转化体、及所述形质转化体培养物构成的群组中的一种以上特异性地水解人参皂苷的第6个碳的糖而转化成去糖基化形态的步骤。在本专利技术中，术语“人参皂苷糖苷酶(Ginesenosideglycosidase)”是指对葡萄糖苷分子键进行水解的酶，具体是指特异性地水解人参皂苷的第6个碳的糖的酶。即便是属于同一糖苷酶的酶，其酶活性也可像糖苷酶、纤维素酶一样具有各种酶活性，因此需要查明具有特异性地水解人参皂苷的第6个碳的糖的活性的适当的酶。由此，本专利技术人等筛选具有如上所述的活性的人参皂苷糖苷酶而确认其功能。就本专利技术的目的而言，所述人参皂苷糖苷酶只要是水解人参皂苷的第6个碳的糖的酶则无限制，具体而言，可为包含以序列1表示的氨基酸序列的人参皂苷糖苷酶。本专利技术的所述人参皂苷糖苷酶不仅包含具有以序列1记载的氨基酸序列的蛋白，而且还包含具有如下人参皂苷糖苷酶的活性的蛋白：作为与所述序列表现出70％以上、具体而言80％以上、更具体而言90％以上、进而具体而言95％以上、最具体而言98％以上的同源性的氨基酸序列，实际包含以所述序列1表示的氨基酸序列。另外，可知作为具有这种同源性的序列，只要是本专利技术的实际上具有与人参皂苷糖苷酶相同或相应的生物学活性的氨基酸序列，则具有序列缺失、变形、取代或附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制造在C‑6位置处去糖基化的次要人参皂苷的方法，其包含：处理选自由以下组成的群组的一个或多个：具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的人参皂苷糖苷酶蛋白；与包含编码所述蛋白的多核苷酸的载体一起引入的转化体；以及在所述C‑6位置处具有糖的人参皂苷的转化体的培养物。

【技术特征摘要】
2015.12.18 KR 10-2015-01817631.一种制造在C-6位置处去糖基化的次要人参皂苷的方法，其包含：处理选自由以下组成的群组的一个或多个：具有氨基酸序列SEQIDNO：1的人参皂苷糖苷酶蛋白；与包含编码所述蛋白的多核苷酸的载体一起引入的转化体；以及在所述C-6位置处具有糖的人参皂苷的转化体的培养物。2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述C-6位置处具有糖的所述人参皂苷为选自由以下组成的群组的一个或多个：Rg1、Rh1、Re、Rg2以及Rf。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖是葡萄糖、Glc(1→2)Glc或rha(1→2)Glc。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含选自由以下组成的群组的一个或多个：将Rg1转化成F1，将Rh1转化成原人参三醇(PPT)，将Re转化成F1，将Rg2转化成PPT以及将Rf转化成F...

【专利技术属性】
技术研发人员：金善昌，林完泽，崔昌浩，
申请(专利权)人：智能合成生物中心，
类型：发明
国别省市：韩国,KR