本发明专利技术公开了一种新的β‑1,6‑葡聚糖酶及其编码基因和应用。本发明专利技术提供了新型的属于糖苷水解酶系的β‑1,6‑葡聚糖酶基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，所编码的外膜型糖苷水解酶蛋白质氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。该β‑1,6‑葡聚糖酶可以有效防止植物病原真菌对植物的侵染。利用该基因构建的工程菌株实现了β‑1,6‑葡聚糖酶基因的原核表达，并对其糖苷水解酶功能进行了验证，结果显示GluM可以有效地抑制稻瘟孢子的萌发，并能将稻瘟孢子分解。将β‑1,6‑葡聚糖酶基因转入到双子叶植物的模式物种拟南芥和单子叶植物的模式物种水稻中，得到的转基因植株分别显示出对灰霉和稻瘟具有较好的抗侵染效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业微生物及植物保护领域，公开了一种新的β-1,6-葡聚糖酶及其编码基因和应用。
技术介绍
植物病害是农作物高质优产的制约因素之一，据统计，全球因为植物病害导致的作物产量损失约占16％，每年直接经济损失多达数亿美元。在植物病害中，70％-80％的病害是由植物病原真菌侵染所引起的。植物真菌病害不仅直接造成作物产量下降和品质降低，而且部分病原真菌在侵染农作物的过程中，还能分泌多种人畜有害的毒素和代谢产物，对农产品的安全造成极大的威胁。植物真菌病害控制难度大，生产上急需有效的控制手段，随着高效、内吸、选择性强的现代杀菌剂被开发和广泛应用，植物病害得到了一定的控制。但是也面临着植物对杀菌剂抗性越来越严重和普遍的状况，导致植物病害病害化学防治失败，农业生产遭受巨大损失。同时，杀菌剂在植物中积累，通过食物链的方式也会对动物造成危害。另外，植物抗病品种选育虽然安全可靠，但是选育过程十分耗时，因此广谱抗真菌蛋白对抗病育种提高植物抗病能力具有重要研究价值。β-1,6-葡聚糖是真菌细胞壁中的特有结构，是专一性的抗真菌靶点。研究发现β-1,6-葡聚糖酶在生防木霉重寄生过程有一定的作用，但对其在抗真菌过程中的作用还未受到重视。到目前为止关于β-1,6-葡聚糖酶的报道也仅有少数几例，来源于TrichodermaharzianumCECT2413的一个酸性β-1,6-葡聚糖酶BGN16.3以及来源于Trichodermaharzianum的内切型β-1,6-葡聚糖酶等。β-1,6-葡聚糖是真菌细胞壁中重要的交联结构，将长链的β-1,3-葡聚糖以及外层甘露聚糖交联形成网状结构，β-1,6-葡聚糖联结的破坏将破坏整个细胞壁结构。β-1,6-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)能够有效的裂解植物病原真菌细胞壁的重要组成成分β-1,6-葡聚糖，从而破坏真菌细胞壁的结构，裂解菌丝，达到生物防治的效果。因此这种抗菌蛋白因其诱发植物自身抗性、可行性强、无种属专一性、作用持久等特点，对抗病育种具有重要价值。同时β-葡聚糖也是白色念珠菌以及造成灰指甲的病原真菌等人源致病菌细胞壁含量最高的多糖，因此，β-1,6-葡聚糖酶同样能够破坏该类病原真菌的细胞壁结构，从而为外涂抗真菌药物的开发提供实验材料。目前来源于微生物的β-1,6-葡聚糖酶主要来源于哈茨木霉以及放线菌，但由于其活性较低以及相关性质的限制影响其应用。因此开发高活性广谱高效抗菌β-1,6-葡聚糖酶具有重要的研究价值以及应用价值。根据报道AFP、β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶已经被成功应用到作物抗病育种中，这也为β-1,6-葡聚糖酶在抗病性作物育种方面提供了方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种全新的β-1,6-葡聚糖酶及其编码基因，所述酶可以通过氨基酸序列基序(一级结构)、二级结构元件以及三级结构元件和氨基酸序列在线BLAST比对来识别。该β-1,6-葡聚糖酶为一种抗病原真菌的广谱抗病蛋白。本专利技术的另一目的是提供含有该β-1,6-葡聚糖酶基因的基因工程菌。本专利技术的又一目的是提供该基因以及该基因所编码的蛋白质的应用。本专利技术所述β-1,6-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列为：SEQIDNO.1，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为3222bp，G+C含量为65.8％，编码1073个氨基酸，理论分子量大小为116.13KD，等电点为5.37。本专利技术所述的β-1,6-葡聚糖酶基因编码的β-1,6-葡聚糖酶蛋白质,其氨基酸序列为：SEQIDNO.2。所述的β-1,6-葡聚糖酶最适反应pH为7.0，最适反应温度为50℃，并在20℃-50℃(1h)和pH5.0-10.0(24h)之间保持活性稳定，该蛋白为典型的β折叠桶状结构，具有专一性水解β-1,6-葡聚糖的功能。本专利技术所述的β-1,6-葡聚糖水解酶的活性分布区域为ATG起始端第79个碱基至第1500个碱基，其核苷酸序列为：SEQIDNO.4；氨基酸区域为N端第27个氨基酸至第500个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQIDNO.5。由本专利技术所述的SEQIDNO.2或SEQIDNO.5序列中一个或者多个氨基酸残基取代、缺失或者添加所得到的多肽或蛋白，具有与本专利技术所述的GluM蛋白相同的β-1,6-葡聚糖水解酶活性的，也在本专利技术保护范围内。本专利技术提供了β-1,6-葡聚糖酶氨基酸序列在线BLAST序列比对，并构建了该蛋白的进化树，得到来源于不同粘细菌属的与本专利技术的β-1,6-葡聚糖酶同源性高于50％的序列，发现相关序列均被预测为通道蛋白(TonBProtein)，与β-1,6-葡聚糖水解酶功能无关。本专利技术随机挑选具有代表性的九个与本专利技术所述的β-1,6-葡聚糖酶氨基酸序列同源性高于50％，且来源于不同种类粘细菌的同源蛋白或者假设蛋白进行异源表达功能验证，发现不同来源的同源蛋白均具有β-1,6-葡聚糖水解活性，这些蛋白也属于本专利技术保护范围。含有本专利技术所述的β-1,6-葡聚糖酶基因，所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的变体，同系物或片段，或所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域的重组表达载体。本专利技术所述的β-1,6-葡聚糖酶基因、该基因的活性分布区域、含有该基因的重组表达载体、含有该基因的宿主菌在构建抗真菌病害植物中的应用。本专利技术提供了含有上述β-1,6-葡聚糖酶基因序列的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述基因序列直接转化或转导的宿主细胞。本专利技术提供了一种抗植物病原真菌的转基因植株，转基因植株的构建过程包括两个主要内容：(1)提供携带表达载体的农杆菌；(2)所述的表达载体含有SEQIDNO.1或者SEQIDNO.4所述的β-1,6-葡聚糖酶的DNA编码序列，或者携带与SEQIDNO.2或者SEQIDNO.5所述氨基酸序列的变体、或者活性多肽片段、或活性多肽衍生物，且编码产物具备β-1,6-葡聚糖酶活性的基因序列；转基因植株的构建过程为：将植物细胞或组织或器官与步骤⑴农杆菌接触，从而使β-1,6-葡聚糖酶基因编码序列转入植物细胞或者组织或者器官，并且整合到植物细胞的染色体。通过对上述转染的植物细胞或者组织或者器官进行再生植株后，得到含有目的基因的阳性转基因植株，对植株进行病原菌抗性鉴定，植株具有良好的抗性水平。本专利以拟南芥和水稻作为转基因对象。本专利技术所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM在植物病害的生物防治方面的应用。本专利技术所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM为一种广谱抗真菌蛋白，本专利以典型的气传病害-稻瘟病菌进行生物防治实验，结果显示良好的抗性水平。本专利技术所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM优选在防治和控制植物病原真菌对植物的损害中的应用。其中，所述的植物病原真菌对植物的损害选自半知菌亚门真菌导致的病害：黄瓜枯萎病，棉花枯萎病，棉花黄枯萎病，草莓枯萎病，水稻稻瘟病，水稻纹枯病，卵菌门疫霉属真菌导致的病害：大豆疫霉菌，辣椒疫霉菌；鞭毛菌亚门单轴霉属真菌导致的病害：葡萄霜霉病；子囊菌亚门单囊壳属真菌导致的病害：草莓白粉病；所述的植物选自本文档来自技高网...
【技术保护点】
β‑1,6‑葡聚糖酶基因，该基因全长核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。
【技术特征摘要】
1.β-1,6-葡聚糖酶基因，该基因全长核苷酸序列为：SEQIDNO.1。
2.权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因编码的β-1,6-葡聚糖酶GluM，其特征在于氨基
酸序列为：SEQIDNO.2。
3.一种SEQIDNO.1所示β-1,6-葡聚糖酶基因的变体，同系物或片段，或者与其互补的序
列，其特征在于具有与SEQIDNO.1所示序列50％以上的相似度。
4.根据权利要求3所述的变体，同系物或片段，或者与其互补的序列，其特征在于与权
利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因核苷酸序列同源性高于50％，来自于孢囊杆菌亚
目下的其他科以及粘球菌科下的其他属，且其编码产物具有β-1,6-葡聚糖酶活性功能。
5.权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域，其特征在于所述的活性分布
区域为从该基因全长的ATG起始端第79个碱基至1500个碱基，其核苷酸序列如SEQID
NO.4所示。
6.权利要求5所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域编码的β-1,6-葡聚糖酶截短片
段，其氨基酸序列为SEQIDNO.5。
7.权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因ATG起始端的78个碱基所编码的26个氨基酸
的信号肽序列，其特征在于氨基酸序列为：SEQIDNO.3。
8.权利要求2或权利要求6所示氨基酸序列的变体、或者活性多肽片段、或活性多肽衍
生物；其特征在于：由SEQIDNO.2或SEQIDNO.5所示序列被一个或者多个氨基酸残
基取代、缺失或者添加而形成的，且具有β-1,6-葡聚糖水解酶活性的氨基酸序列。
9.与权利要求2和权利要求6所述的β-1,6-葡聚糖酶氨基酸序列同源性高于50％的氨基
酸序列，来自于孢囊杆菌亚目下的其他科以及粘球菌科下的其他属，且具有β-1,6-葡
聚糖酶活性功能。
10.用于检测权利要求2所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM、权利要求6所述的β-1,6-葡聚糖酶
截短片段、权利要求8所述的变体、或者权利要求2所述的β-1,6-葡聚糖酶GluM的同
源蛋白或者肽段的抗体，其特征在于制备抗体所用的肽段序列为SEQIDNO.9或10或
11。
11.含有权利要求1所述的β-1,6-葡聚糖酶基因，权利要求3所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的
变体，同系物或片段，或权利要求5所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域的重
组表达载体。
12.含权利要求11所述的重组表达载体的基因工程菌，或由权利要求1所述的β-1,6-葡聚
糖酶基因、权利要求3所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的变体，同系物或片段，权利要求5
所述的β-1,6-葡聚糖酶基因的活性分布区域直接转化或转导宿主菌所获得的基因工程
菌，其特征在于以E.coliBL21(DE3)为宿主菌。
13.权利要求12所述的基因工程菌的应用，其特征在于所述的基因工程菌用于发酵产...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔中利，李周坤，张碧滢，叶现丰，黄彦，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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