有机磷水解酶变体制造技术

本发明专利技术涉及有机磷水解酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】序列表的引用本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。背景专利技术领城本专利技术涉及有机磷水解酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。相关领域描述本领域已知有机磷化合物。特别地，众所周知一些战剂是有机磷化合物，例如G-型神经药剂，例如萨林(Sarin)、环萨林(Cyclosarin)、和索曼(Soman)，以及V-型神经药剂，例如VX。其他有机磷化合物作为杀有害生物剂为人所知。希望的是能够净化被上述有机磷化合物污染的区域。已提出将具有有机磷水解酶活性如二异丙基氟磷酸酶(diisopropylfluoirophosphatase)活性的多肽用于此目的，因为此类多肽能够水解有害的有机磷化合物并由此将其转化为有害性较低的产物。在WO 99/43791中披露了一种来自欧洲乌贼(Loligo vulgaris)的二异丙基氟磷酸酶并且还描述了其除其他应用之外的用于净化的潜在用途。WO 2009/130285、WO 2010/128115和WO 2010/128116披露了来自假交替单胞菌(Pseudoalteramonas haloplanktis)、章鱼(Octopus vulgaris)、和加州海兔(Aplysia californica)的其他二异丙基氟磷酸酶。本专利技术提供了与其亲本相比具有改进的特性的有机磷水解酶变体。专利技术概述本专利技术涉及有机磷水解酶变体，这些变体在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代，其中这些变体具有有机磷水解酶活性。本专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及生产这些变体的方法。本专利技术还涉及净化暴露于有机磷化合物像神经毒气、毒素、或杀有害生物剂的环境或表面的方法。定义有机磷水解酶：术语“有机磷水解酶”在此定义为对有机磷化合物，特别是有机磷化合物(包括神经毒气)中的磷酐键的水解活性。因此，该术语包括具有水解酶活性和/或酯酶活性例如有机磷水解酶活性(例如有机磷酯酶活性)或有机磷酸脱水酶(OPAA)活性、或羧酸酯酶活性、二异丙基氟磷酸酶(DFP酶)活性(EC 3.1.8.2)、脱卤素酶活性、催化磷-硫键的水解的、具有脯氨酸肽酶活性和/或亚氨基二肽酶活性的酶。术语“DFP酶”(EC3.1.8.2)在此被定义为二异丙基氟磷酸酶、二烷基氟磷酸酶、二异丙基氟磷酸水解酶、二异丙基氟磷酸脱卤素酶、二异丙基磷氟化酶(diisopropylphosphofluoridase)、异丙基磷氟化酶(isopropylphosphorofluoridase)、有机磷酸酯酸脱水酶、有机磷酸脱水酶、索曼分解酶、塔崩酶。DFP酶作用于有机磷化合物(包括神经毒气)中的磷酐键(例如磷-卤化物以及磷-氰化物)。出于本专利技术的目的，根据实例2中所述的程序确定有机磷水解酶活性。在一个方面中，本专利技术的这些多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的有机磷水解酶活性。净化：术语“净化”在此应被理解为去除、分解或破坏有害药剂，例如有机磷化合物，例如神经毒气、毒素、杀有害生物剂，从而该术语包括例如解毒活性。等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有有机磷水解酶活性。在一方面，该片段包含至少290个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸24至313)、至少300个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸24至323)、或至少308个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸24至331)。高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本专利技术的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。改进的活性：术语“改进的活性”意指与亲本，例如，如在实例中描述的相比而言改进的变体的有机磷水解酶活性。分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有机磷水解酶变体，包括在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置K34、D37、D38、P58、G59、R61、D63、D91、I94、C96、M111、E164、F165、K166、M167、F169、Q170、E171、R193、F194、T216、R219、D243、E245、Q246、E247、G248、P250、W266、D290、K291、S293、和N312，优选位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有有机磷水解酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.28 EP 13194860.61.一种有机磷水解酶变体，包括在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置K34、D37、D38、P58、G59、R61、D63、D91、I94、C96、M111、E164、F165、K166、M167、F169、Q170、E171、R193、F194、T216、R219、D243、E245、Q246、E247、G248、P250、W266、D290、K291、S293、和N312，优选位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有有机磷水解酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。2.如权利要求1所述的变体，该变体是亲本有机磷水解酶的变体，该亲本有机磷水解酶选自下组，该组由以下各项组成：(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；(b)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％一致性的多核苷酸编码的多肽；以及(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段具有有机磷水解酶活性。3.如权利要求1所述的变体，该变体是亲本有机磷水解酶的变体，该亲本有机磷水解酶选自下组，该组由以下各项组成：(a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；(b)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；(c)由与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％一致性的多核苷酸编码的多肽；以及(d)SEQ ID NO:4的成熟多肽的片段，该片段具有有机磷水解酶活性。4.如权利要求2所述的变体，其中该亲本有机磷水解酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。5.如权利要求3所述的变体，其中该亲本有机磷水解酶与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。6.如权利要求2所述的变体，其中该亲本有机磷水解酶包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。7.如权利要求2所述的变体，其中该亲本有机磷水解酶是SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，其中该片段具有有机磷水解酶活性。8.如权利要求3所述的变体，其中该亲本有机磷水解酶包括SEQ ID NO:4的成熟多肽或由其组成。9.如权利要求3所述的变体，其中该亲本有机磷水解酶是SEQ ID NO:4的成熟多肽的片段，其中该片段具有有机磷水解酶活性。10.如权利要求2-9中任一项所述的变体，该变体与该亲本有机磷水解酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。11.如权利要求1-10中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-20个，例如1-10和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。12.如权利要求1-11中任一项所述的变体，该变体包括在对应于位置P58的位置处的取代；优选地，该取代是Ala、Gly、Met、Ser、或Val。13.如权利要求1-12中任一项所述的变体，该变体包括在对应于位置R61的位置处的取代；优选地，该取代是Ile、Leu、Asn、Pro、或Val。14.如权利要求1-13中任一项所述的变体，该变体包括在对应于位置F165的位置处的取代；优选地，该取代是Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Ser、或Val。15.如权利要求1-14中任一项所述的变体，该变体包括在对应于位置M167的位置处的取代；优选地，该取代是Ala、Gly、Ile、Ser、或Val。16.如权利要求1-15中任一项所述的变体，该变体包括在对应于位置R193的位置处的取代；优选地，该取代是Asn或Gln。17.如权利要求1-16中任一项所述的变体，该变体包括在对应于位置P250的位置处的取代；优选地，该取代是Ala、Gly、Ile、或Met。18.如权利要求1-17中任一项所述的变体，该变体包括在对应于位置N312的位置处的取代；优选地，该取代是Asp。19.如权利要求1-18中任一项所述的变体，该变体在与位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312中的任何所相对应的两个位置处包括取代。20.如权利要求1-19中任一项所述的变体，该变体在与位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312中的任何所相对应的三个位置处包括取代。21.如权利要求1-20中任一项所述的变体，该变体在与位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312中的任何所相对应的四个位置处包括取代。22.如权利要求1-21中任一项所述的变体，该变体在与位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312中的任何所相对应的五个位置处包括取代。23.如权利要求1-22中任一项所述的变体，该变体在与位置P58、R61、F165、M167、R193、P250、和N312中的任何所相对应的六个位置处包括取代。24.如权利要求1-23中任一项所述的变体，该变体在与位置P58、R61、M167、F165、R193、P250、和N312相对应的每个位置处包括取代。25.如权利要求1-24中任一项所述的变体，该变体包括与选自下组的取代相对应的一个或多个取代，该组由以下各项组成：K34A、D37A、D37N、D37S、D37T、D38A、D38E、D38N、P58A、P58G、P58M、P58S、P58V、G59A、G59P、G59S、G59T、R61I、R61L、R61N、R61P、R61V、D63E、D63N、D63R、D91N、D91S、D91T、I94A、I94F、I94G、I94V、C96A、C96G、M111A、M111G、E164A、E164P、F165A、F165G、F165I、F165L、F165M、F165S、F165V、K166S、K166T、M167A、M167G、M167I、M167S、M167V、F169I、F169L、F169V、F169W、F169Y、Q170D、Q170E、...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·G·汉森，L·K·斯科乌，L·德玛利亚，J·B·兰内斯，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK