本发明专利技术公开了一种来源于食木天牛的功能基因及其表达产物和应用，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，及由该基因编码的多功能纤维素酶，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明专利技术利用RACE方法从云斑天牛中克隆出编码多功能纤维素酶的基因，经系统发育分析表明，由昆虫内源性的GHF5纤维素酶组成的真核生物组区别于原核的GHF5纤维素酶组或线虫GH5纤维素酶组，且相对于其他家族，该酶能够消化坚韧的新鲜的木质纤维素；且其同时具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β‑葡聚糖苷酶的活性，单位酶活力为816U/mg；本发明专利技术所述多功能纤维素酶能够利用新鲜的植物或秸秆为原料合成生物能源，即能够高效分解木质生物质生产葡萄糖，进而为生物乙醇的合成提供原料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种新的功能基因，尤其涉及一种来源于食木天牛的功能基因及其表达产物和应用。
技术介绍
木质纤维素是由纤维素、半纤维素和木质素组成的聚合物。木材及大量的农业废弃物，如小麦和水稻秸秆，其主要成分是木质纤维素，他们是地球上最丰富的可生产乙醇的可再生资源。除了生产生物燃料和生物乙醇外，来源于木质纤维素的半纤维素、低聚糖是生产化学胶片、保护胶体和动物饲料的主要原料；木糖可转化为木糖醇、有机酸；木质素衍生品可以转化为塑料、呋喃、尼龙等。其他可再生能源在未来可能面临衰竭，因此，木质纤维素是宝贵的可再生资源。尽管自然界存在着大量的天然植物纤维素，但目前人类所利用的能量中，只有2％是从纤维素转换而来。提高纤维素的生物能源利用效率的瓶颈是纤维素的降解和糖基化。虽然可以用物理或化学的方法分解纤维素，但是存在着能量消耗和环境污染两大问题。因此，人类必须找到一个既可提高生物质转化效率又可减少污染和能源需求的新方案。在自然界中，可协同降解纤维素(聚合物β-1,4-glucan)的水解酶是糖苷水解酶家族(glycosidehydrolasefamilies，GHFs)。昆虫源纤维素酶基因属于三个不同的蛋白质家族：内切葡聚糖酶[(endo-β-1,4-D-glucanase)，EC3.2.1.4]、外切葡聚糖酶[(exo-1,4-β-D-glucanase)，EC3.2.1.91]、β-葡聚糖苷酶[(β-1,4-glucosidase)，EC3.2.1.21,BG]，这三种酶协同作用可以将纤维素降解成寡糖或单糖。到目前为止，虽然从真菌、细菌和原生动物中克隆和鉴定出大量的纤维素酶基因，但是从动物体内克隆出的内源性纤维素酶极少。1998年，首次报道在无共生菌的动物分泌腺体中存在纤维素酶，Watanabe等从白蚁唾液腺中克隆到纤维素酶，Smant等在植物寄生孢囊线虫中发现内源性纤维素酶。在无脊椎动物中，一些能消化纤维素的内源性纤维素酶(endo-b-1,4-glucanase)基因已被分离和鉴定，如节肢动物(昆虫、小龙虾)和线虫。植食性昆虫的内源性纤维素酶基因也被克隆与分析，例如：辣根猿叶虫(Phaedoncochleariae)、白蚁、三化螟甲虫(Oncideresalbomarginatachamela)、马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)、山杨叶甲(ChrysomelatremμLa)、米象(Sitophilusoryzae)、松大小蠹(Dendroctonusponderosae)的内切β-1,4-葡聚糖酶等。天牛科内源性纤维素酶的研究是新的热点。天牛是木材的主要害虫，其克隆的纤维素酶家族成员与白蚁的纤维素水解酶不同。天牛幼虫的消化道的结构不同于白蚁，其相对较小的后肠表明这类昆虫在降解纤维素时，可能是自主的或不依赖共生。大多数的微生物、白蚁消化死亡或腐烂的植物组织。然而，天牛幼虫钻入坚硬的活树木质部，降解尚未分解的纤维素。人类利用新鲜的植物或秸秆合成生物能源，因此对天牛可分解坚硬新鲜组织的独特的纤维素酶的未来应用特别感兴趣。目前，已报道了多个天牛源内源性纤维素酶基因，例如：云斑天牛；桑天牛；黄星天牛(Psacotheahilarisbeetle)；星天牛等等。已知昆虫纤维素酶分为3个糖基水解酶家族(Glycosylhydrolasefamilies，GHFs)。分别为GHF9、GHF5、GHF45。已报道的来源于GHF9的endo-1,4-β-glucanases有白蚁，吃木材的蟑螂和蟋蟀；属于GHF45有Phaedoncochleariae、Aprionagermari.；属于GHF5有Psacotheahilaris。GHF45有1个非常保守的催化结构域；而GHF5有2个非常保守的催化结构域，1个是质子供体区域，1个是亲核区域；GHF9与GHF5相似，也有2个非常保守的催化结构域。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种新的功能基因及其表达产物，且该表达产物能够利用新鲜的植物或秸秆最终合成生物能源，本专利技术提供了一种来源于食木天牛的功能基因及其表达产物和应用。技术方案：一种来源于食木天牛的功能基因，所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。优选的，所述基因包括3'UTR和一个978bp编码325个氨基酸残基的完整的开放阅读框。一种多功能纤维素酶，是由上述功能基因编码的蛋白，氨基酸序列为SEQIDNO:2。优选的，所述氨基酸序列中含有1个假定的N-糖基化位点300-302；其蛋白质分子量为37.1kDa，等电点为4.28。优选的，所述多功能纤维素酶含有1个GHF5非常保守的潜在质子供体156-165和1个亲核试剂246-254。优选的，所述多功能纤维素酶的最适pH为5.0，在pH4.0-8.0的范围内，酶的活性为60％以上；最适pH条件下，其最适反应温度为40℃，在30℃-80℃的范围内，其酶活力为60％以上。优选的，所述多功能纤维素酶具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶的活性。所述的多功能纤维素酶的制备方法，包含以下步骤：本专利技术采用的材料为：云斑天牛(鞘翅目：天牛科)在桑园中收集，采用人工饲料饲养；家蚕(商业名称：54A)是中国农业科学院蚕业研究所培育、保存；蚕幼虫在25℃，相对湿度65％±5％和光周期12光亮:12黑暗的条件下，用鲜桑叶饲养，当幼虫生长到第五龄起蚕时，分成几组注入重组病毒DNA。家蚕BmN细胞及野生型家蚕核型多角体病毒(BmNPV)为江苏大学生命科学院保存。(1)获取目的基因将云斑天牛中肠经冰上解剖后-80℃冻存，采用RNeasy试剂盒(Qiagen公司)提取中肠组织的总RNA，用分光光度计检测总RNA的浓度与纯度，并将总RNA浓度稀释到1μg/μL，-80℃保存备用。以RNA为模板用反转录酶M-MLV、oligo-dT(TaKaRa公司)反转录合成相应的cDNA。该基因是来源于云斑天牛(Batocerahorsfieldi)中肠中的属于糖苷水解酶家族5(glycosidehydrolasefamilies5，GHF5)的纤维素酶(cellulase)，故命名为Bh-CGHF5。与已知昆虫源纤维素酶基因(GenBank登录号：AY771358、AB080266、KJ186853)进行比对，根据保守核苷酸序列设计合成目的基因引物，SEQIDNO:3～5，如表1所示。采用Clontech公司的SMARTRACEcDNAAmplificationKit进行Bh-CGHF5基因5’、3’-RACE。根据5'-RACE、3'-RACE的测序结果，对Bh-CGHF5的全长核苷酸序列进行电子拼接。根据拼接结果设计合成引物对，SEQIDNO:6～7，如表1所示，以云斑天牛GenomicDNA为模板，进行目的片段PCR扩增，产物经回收、酶切、连接、转化、重组质粒的快速抽提鉴定按Sambrook方法进行。阳性克隆菌液送到上海生物工程公司测序，测序结果如SEQIDNO:1所示。表1克隆目的基因的引物(2)构建重组质粒及重组BmNPV病毒以云斑天牛中肠cDNA为模板，进行PCR扩增，回收目的基因，双酶切目的片段及pFastBacT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于食木天牛的功能基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
【技术特征摘要】
1.一种来源于食木天牛的功能基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。2.根据权利要求1所述的一种来源于食木天牛的功能基因，其特征在于，所述基因包括3'UTR和一个978bp编码325个氨基酸残基的完整的开放阅读框。3.一种多功能纤维素酶，其特征在于，由权利要求1所述的功能基因编码的蛋白，氨基酸序列为SEQIDNO:2。4.根据权利要求3所述的一种多功能纤维素酶，其特征在于，所述氨基酸序列中含有1个假定的N-糖基化位点300-302；其蛋白质分子量为37.1kDa，等电点为4.28。5.根据权利要求3所述的一种多功能纤维素酶，其特征在于，所述多功能纤维素酶含有1个GHF5非常保守的潜在质子供体156-165和1个亲核试剂246-254。6.根据权利要求3所述的一种多功能纤维素酶，其特征在于，所述多功能纤维素酶的最适pH为5.0，在pH4.0-8.0的范围内，酶的活性为60％以上；最适pH条件下，其最适反应温度为40℃，在30℃-80℃的范围内，其酶活力为60％以上。7.权利要求3～6任一所述的多功能纤维素酶的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)获取目的基因将云斑天牛中肠经冰上解剖后-80℃冻存，采用RNeasy试剂盒提取中肠组织的总RNA，以RNA为模板用反转录酶M-MLV、oligo-dT反转录合成相应的cDNA；设计目的基因引物SEQIDNO:3～7，以云斑天牛GenomicDNA为模板，扩增出目的基因；(2)构建重组质粒及重组BmNPV病毒以云斑天牛中肠cDNA为模板，进行PCR扩增，回收目的基因，双酶切目的片段及pFastBacTM1质粒，回收酶切产物，经连接、转化、重组质粒筛选、鉴定后，获得重组质粒pFast-BhCGHF5；利用BmNPV/Bac-to-Bac表达系统构建重组Bacmid，阳性重组质粒转化感受态细胞BmDH10Bac，获得重组BacmidDNA；(3)重组Bacmid转染BmN细胞家蚕卵巢细胞培养BmN，在含12％胎牛血清的昆虫TC-100培养基中培养，在离心管中准备两种溶液，A：将BacmidDNA1ug加入100μL无胎牛血清的TC-100培养基中，B：8...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏定国，梅慧珍，赵巧玲，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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