本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及L-半胱氨酸的酶法转化制备方法。该制备方法采用含有L-丝氨酸的混合氨基酸料液为原料，将具有L-色氨酸合成酶活性的湿菌体或粗酶液与含有L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，添加适量硫氢化物或硫化物，25～55℃，pH6～11条件下进行酶促反应，将反应生成的L-半胱氨酸通空气或滴加双氧水氧化，等电点结晶法分离得到L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法解决了混合氨基酸料液中L-丝氨酸的分离及综合利用难题，得到了附加值较高的L-半胱氨酸产品，具有原料来源广、价格低廉，操作简便，酶促转化时间短、生产成本低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及L-半胱氨酸的酶法转化制备方法。
技术介绍
L-半胱氨酸是自然界存在的氨基酸，也是人体的非必需氨基酸之一，其所带的巯基具有重要的生理功能。L-半胱氨酸及其衍生物可用于医药领域、化妆品工业、食品领域和饲料添加剂领域等，具有非常广泛的应用。根据目前文献报导L-半胱氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法、发酵法和酶转化法。1、提取法目前国内生产L-半胱氨酸主要以人或动物毛发为原料，先经酸水解提取L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法大规模工业化生产受到原料来源的限制，产物中易混入其它氨基酸，分离难度大，环保成本高。也有厂家在生产L-半胱氨酸的相关产品中回收L-胱氨酸，曾庆群等(CN 101104599A,2008)对N-乙酰-L-半胱氨酸生产过程中排放的废液进行氧化处理，分离回收了 L-胱氨酸，提高了原料利用率，降低了生产成本。但是，近年来随着人们环保意识的增强或宗教信仰等原因，一些西方国家禁用由动物毛发为原料制得的L-半胱氨酸，因此寻求新的制备L-半胱氨酸的方法势在必行。2、化学合成法化学合成法是利用氯代烷类化合物经过氧化反应、加成反应、还原反应、取代反应，最后得到DL-半胱氨酸。化学合成法不仅步骤较多，而且得到的产物通常为外消旋体， 需经拆分后才能得到具有生理活性的L-半胱氨酸。马云峰(CN 1876628A, 2006)以DL-半胱氨酸为原料，以无机酸为溶剂，以D- 二苯甲酰酒石酸或L- 二苯甲酰酒石酸为拆分剂，将外消旋半胱氨酸与拆分剂按一定摩尔比溶于稀的无机酸溶液中，保温搅拌、冷却结晶，分别制得L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。3、发酵法目前发酵法生产L-半胱氨酸正处于实验室探索阶段，其主要问题是微生物体内的L-半胱氨酸合成过程复杂，且巯基来源难以解决。张建国(CN 101831397A，2010)利用基因改造的大肠杆菌BL21(DE3)，在含葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化钠、硫代硫酸钠等成分的培养基中发酵产生了 L-半胱氨酸， 基因改造前的大肠杆菌BL21 (DE3)L-半胱氨酸产量几乎为0，而基因改造后的BL21 (DE3) L-半胱氨酸产量达到lg/L。托马斯·迈尔(CN 1262646C，2006)采用半胱氨酸代谢去调节、CysB活性增加的改造菌株，在含葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等成分的培养基中补料分批发酵，流加葡萄糖及硫代硫酸盐，发酵4 后发酵液中L-半胱氨酸含量达到22. 6g/L。Takagi Hiroshi (EP1234874, 2002)以棒状杆菌为出发菌株，通过基因改造提高胞内丝氨酸乙酰转移酶活性，同时降低半胱氨酸脱巯基酶活性，在含葡萄糖、硫酸铵等成分的产半胱氨酸培养基中发酵，积累了 L-半胱氨酸和L-胱氨酸。4、酶转化法自 1979 年 Sano K.等(Applied and Environmental Microbiology, 34 (6) 806-810,1977)发现嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌转化DL-2-氨基-Δ 2-噻唑啉-4-羧酸 (DL-ATC)为L-半胱氨酸以来，酶法生产L-半胱氨酸已成为近年来人们关注和研究的方向。 酶法转化因具有专一性强、反应条件温和、环境友好等优点而日益受到重视。日本具有用DL-ATC为原料酶法制备L-半胱氨酸较为成熟的生产工艺，国内学者也做了相关研究。王普(CN 100467587C,2009)以假单胞菌ζjwp_14湿菌体或粗酶液为酶源，以DL-ATC为底物，于20 52°C酶促转化1 9h，得到含L-半胱氨酸的反应液，经分离提取制得L-半胱氨酸。陈宁(CN 101348809A,2009)以恶臭假单胞菌(I^seudomonas putida) TS-1138为供试菌种，以全细胞为酶源酶法转化DL-ATC合成了 L-半胱氨酸。以DL-ATC为底物酶法合成L-半胱氨酸，需要化学合成DL-ATC，且酶转化过程中需要多步酶促反应，整体催化效率不高。焦庆才等(BioresourceTechnology, 102 :3554-3557,2011)以 L-丝氨酸和吲哚为底物，以色氨酸合成酶基因工程菌DM206(pETj8a-trpBA/BL21)酶法合成了 L-色氨酸。 但据文献报道色氨酸合成酶不仅能够催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸，还能催化L-丝氨酸和硫氢化钠反应生成L-半胱氨酸。Ken-ichi Ishiwata等(Journal of Fermentation and Bioengineering, 67 (3) 169-172，1989)以L-丝氨酸和硫氢化钠为底物，色氨酸合成酶酶法合成了 L-半胱氨酸，在最佳条件下反应液中L-半胱氨酸达到114g/L，转化率是以L-丝氨酸和吲哚为底物酶法合成L-色氨酸的47%。日本专利(JP62215396-A，1987 ； JP63007790-A, 1988)报道了以 L-丝氨酸为底物， 以硫化氢或硫氢化物或硫化物为巯基供体，色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸。日本专利 (JP62019098-A, 1987)以DL-丝氨酸和硫化物为底物，用色氨酸合成酶将L-丝氨酸转化生成L-半胱氨酸或L-胱氨酸，同时分离制备了 D-丝氨酸。以上色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸的报道均以L-丝氨酸纯品为底物，目前 L-丝氨酸和L-半胱氨酸的生产成本大体相当，故以L-丝氨酸纯品酶法合成L-半胱氨酸无现实意义。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是提供一种高效、低成本的制备L-半胱氨酸的方法。本专利技术以氨基酸工业中富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液代替L-丝氨酸纯品，以色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸。本专利技术可以通过以下技术方案来达到L-半胱氨酸的酶法转化制备方法，其步骤为(1)色氨酸合成酶基因工程菌DM206 (pET-28a-trpBA/BL21)，在含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或乳糖的培养基中培养，诱导产生色氨酸合成酶；(2)将含有色氨酸合成酶的湿菌体或粗酶液与含L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入适量磷酸吡哆醛、表面活性剂、硫氢化钠或硫化钠或硫氢化铵或硫化铵或硫化氢，在25 55°C，pH 6 11条件下进行酶促反应；将反应生成的L-半胱氨酸氧化后分离得到L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。上述步骤(1)中的培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1 20g/L ；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1 30g/L ；加入IPTG或乳糖诱导，IPTG终浓度为0. 05 0.15g/L，乳糖终浓度为5 15g/L。上述步骤O)中含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为角蛋白水解液或蚕丝水解液或酶法合成L-丝氨酸的反应液，混合氨基酸料液中总氨基酸含量(w/w)为10% 50%，其中 L-丝氨酸在总氨基酸中含量(w/w)为10% 95%。上述步骤( 的转化液中加入适量的表面活性剂吐温-80或十六烷三甲基溴化铵 (CTAB)或聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其浓度为0. 005g/L 5. Og/L。目前，我国L-半胱氨酸生产主要来源于毛发水解提取法，该方法工艺成熟，但大规本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：焦庆才，刘均忠，刘茜，肖国安，王先兵，曾庆群，
申请(专利权)人：南京大学，湖北新生源生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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