一种酶法转化生产Ｌ－半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备及应用。本发明专利技术以甲苯为渗透剂，处理菌悬液获得ＴＳ－１１３８菌株透性化细胞，其酶活高达２２９．９Ｕ／克，约为原始细胞的７倍。在冷冻干燥透性化细胞中，采用谷氨酸钠、甘油和甘露醇为复合冻干保护剂，冷冻干燥后的残存酶活最高达６６．７％，４℃贮存３个月后，酶活仍可以保持９０％以上。在喷雾干燥细胞中，可采用谷氨酸钠、阿拉伯胶或牛肉浸膏为保护剂，喷雾干燥后残存酶活最高达６８．９２％，制得的喷干酶粉活力达６１４．７Ｕ／克，在４℃密封可稳定保存３个月。本发明专利技术所获得的微生物固体酶制剂活性高利于保存，可用于酶法制备Ｌ－半胱氨酸的工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备及应用
本专利技术利用微生物固体酶制剂酶法转化生产氨基酸，属于生物
涉及微 生物细胞的渗透处理以及冷冻或喷雾干燥，及其在转化生产L-半胱氨酸中的应用。
技术介绍
L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品以及饲料等 行业。目前我国L-半胱氨酸的生产以毛发水解为主，产量低、能耗高，水解过程中产生大量 废气及废酸，污染环境。而利用酶法制备L-半胱氨酸具有反应条件温和、专一性强、效率 高、副产物少、对环境友好等优点，对节能减排、发展低碳经济具有重要意义，长期以来相关 技术被国外公司垄断。2003年，刘忠等人(微生物学通报，2003，30 (6) :16 21)分离筛选出一株具 有转化 DL-2-氨基-Δ2 噻唑啉-4 羧酸(DL-2-Amino-A2thiazoline-4-Carboxylic Acid, DL-ATC)生成L-半胱氨酸能力的假单胞菌TS-1138菌株，经鉴定为恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)(天津大学学报，2007，40 (4) :421 426)。金永杰等人(微生物学通报，2004，31 (6) :68_72)对假单胞菌TS-1138菌株转化 DL-ATC的相关酶系进行了分离纯化和酶学性质研究，纯化了 L-ATC水解酶和L-SCC水解酶， 两种酶的相对分子质量分别为37. 5kD和42. 8kD，酶促反应的最适温度均为35°C，最适反应 PH分别为7. 0和8. 0，Km值分别为0. 67毫摩尔/升和0. 15毫摩尔/升，最大反应速度分 别为0. 39X 10_3毫摩尔/升·分钟和0. 42X 10_3毫摩尔/升·分钟。余养盛等人(Biosci.Biotechnol. Biochem.，2006，70 (9) 2262 2267)对恶臭假 单胞菌TS-1138菌株转化DL-ATC的相关基因进行了研究，构建了 TS-1138菌株的基因组随 机文库，克隆到两个新的基因(tsB，tsC)，并在大肠杆菌中进行了表达，对表达产物进行功 能鉴定的结果表明，tsB基因编码L-ATC水解酶，tsC基因编码L-SCC酰胺水解酶，从而在分 子水平上证明了 DL-ATC的转化途径。余养盛等人进一步发现(Frontiersof Biology in China, 2007, 2 (4) 391-396)，假单胞菌TS-1138菌株细胞内同时还存在L-半胱氨酸脱巯基酶，该酶可将L-半 胱氨酸分解为丙酮酸、H2S和NH3,从而影响L-半胱氨酸的积累。通过向酶促反应液中添加 羟胺或氨基脲可以部分抑制L-半胱氨酸脱巯基酶的活性，避免产物的分解。余养盛和刘春琴等人分别对TS-1138菌株细胞转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的 转化条件进行了报道(生物技术通讯，2006，17 (6) :911-913;微生物学通报，2008，35(1) 45-49)，其最适酶促反应条件为反应温度42°C，反应体系pH 8. 0，反应时间2. 5小时，底物 浓度6克/升，细胞悬液浓度250克/升，反应体系中羟胺浓度1摩尔/升。在最适酶促反 应条件下，由DL-ATC转化为L-半胱氨酸的摩尔转化率为96. 8%。此外，中国专利(申请号200710056754. 9)报道了一种微生物转化生产胱氨酸的 方法。该专利技术以恶臭假单胞菌TS-1138细胞为酶源的情况下，以羟胺为抑制剂，酶法转化底3物ATC得到L-半胱氨酸水溶液，并通过进一步氧化方式将所述的半胱氨酸转化成胱氨酸的 方法。该方法直接利用菌体细胞为酶源催化底物，转化效率在90%以上。在上述转化反应研究中，均使用TS-1138菌株的培养细胞为酶源，酶源细胞用量 大(250克/升)，产物生成量相对少，并且酶源细胞需现用现制，因稳定性差而无法长期保 存，导致使用不便，影响了该技术的产业化。
技术实现思路
现有的微生物酶法转化生产L-半胱氨酸的报道中使用的酶源均为TS-1138菌株 的静息细胞(生物技术通讯，2006，17 (6) :911-913;微生物学通报，2008，35(1) :45_49;中 国专利200710056754. 9)，催化反应的酶源细胞用量大，产物生成量少，并且酶源细胞需现 用现制，因稳定性差而无法长期保存，导致使用不便。本专利技术目的是为解决上述问题，提供 一种酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备及应用。具体是通过细胞透性 化处理提高TS-1138菌株细胞的催化活性，同时通过将透性化细胞进行冷冻干燥或喷雾干 燥，获得可长期保存的酶制剂，为L-半胱氨酸酶法生产奠定了基础。渗透处理细胞技术，是指在不破坏细胞完整结构的前提下，改变细胞壁和细胞膜 的通透性，从而使低分子量物质能够自由进出细胞的技术。通过这种方法获得的细胞通常 称为透性化细胞。而对微生物细胞的干燥通常采用真空冷冻干燥和喷雾干燥技术。真空冷 冻干燥简称冻干，是冷冻技术与真空技术相结合的干燥脱水技术。冻干产品含水量低，不易 被氧化，有利于运输、销售和长期保存。喷雾干燥是一种应用广泛、经济、简便的物料干燥方 法，喷雾干燥直接通过雾化的方式形成雾滴并在与热气体介质接触的过程中蒸发溶剂，从 而产生干燥粉末，由于水分蒸发和受热时间短，可通过控制操作条件和加入合适的保护剂， 最大限度地防止活性物质的变性，从而制备稳定的粉粒状产品。针对真空冷冻干燥或喷雾 干燥过程中酶容易失活的问题，选择合适的保护剂和喷雾干燥的条件至关重要。本专利技术利用细胞渗透处理技术在不破坏恶臭假单胞菌TS-1138菌株细胞整体结 构的前提下，改变了细胞壁和细胞膜的通透性，提高了底物和产物的传质效率。本专利技术提供的酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备方法是采 用恶臭假单胞菌TS-1138菌体细胞，以甲苯为渗透剂，渗透处理获得透性化细胞，采用冷冻 干燥或喷雾干燥获得透性化细胞干粉，即可用于酶法转化生产L-半胱氨酸的微生物固体 酶制剂。其中，渗透剂甲苯的浓度范围在0. 至5% (ν/ν)，最佳浓度为2%，渗透处理的 温度范围为15-35°C，最佳温度为25°C，处理时间为15-90分钟，最佳时间为30分钟。在 最佳渗透条件下，所得透性化细胞的酶活可达229. 9U/克，约为对照(静息细胞)的7倍。 TS-1138菌体细胞经透性化处理后，转化DL-ATC生成L-半胱氨酸的最适反应温度为35°C， 与L-ATC水解酶和L-SCC酰胺水解酶的最适反应温度相同。透性化细胞的最适反应pH为 8. 0。在冷冻干燥获得透性化细胞干粉的制备工艺中，本专利技术采用Plackett-Burman设 计法和响应面分析法获得了一种优化的复合冻干保护剂，复合冻干保护剂为谷氨酸钠、甘 油和甘露醇的混合物，浓度范围分别为谷氨酸钠5-15克/升、甘油10-50毫升/升和甘 露醇10-50克/升，其中最佳浓度为谷氨酸钠11. 21克/升、甘油32毫升/升和甘露醇35克/升。在最佳条件下，使透性化细胞冻干后的残存酶活由12. 5%提高到66.7%。冻干透 性化细胞室温贮存3个月，依旧保持90%以上的活性，而静息细胞4°C贮存7天酶活损失在 50%以上。通过单因素实验和响应面分析实验，确本文档来自技高网...
【技术保护点】
酶法转化生产Ｌ－半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备方法，其特征在于：采用恶臭假单胞菌ＴＳ－１１３８菌体细胞，以甲苯为渗透剂，渗透处理获得透性化细胞，采用冷冻干燥或喷雾干燥获得透性化细胞干粉，即酶法转化生产Ｌ－半胱氨酸的微生物固体酶制剂。
【技术特征摘要】
酶法转化生产L 半胱氨酸的微生物固体酶制剂的制备方法，其特征在于采用恶臭假单胞菌TS 1138菌体细胞，以甲苯为渗透剂，渗透处理获得透性化细胞，采用冷冻干燥或喷雾干燥获得透性化细胞干粉，即酶法转化生产L 半胱氨酸的微生物固体酶制剂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于渗透剂甲苯的体积浓度范围在0.至 5%，渗透处理的温度范围为15-35°C，处理的时间范围为15-90分钟。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于甲苯的最佳体积浓度为2%，渗透处理的最 佳温度为25°C，处理的最佳时间为30分钟。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用冷冻干燥获得透性化细胞干粉的制 备工艺中，使用的复合冻干保护剂为谷氨酸钠、甘油和甘露醇的混合物，浓度范围分别为谷 氨酸钠5-15克/升、甘油10-50毫升/升和甘露醇10-50克/升。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于复合冻干保护剂中谷氨酸钠的最佳浓度 为11. 21克/升、甘油32毫升/升和甘露醇35克/升。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用喷雾干燥获得透性化细胞干粉的制 备工...
【专利技术属性】
技术研发人员：高智慧，张奇，刘磊，陈晓芸，张玺，姚瑞娟，
申请(专利权)人：天津启仁医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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