与精氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现制造技术

本文提供了包含氨酰-tRNA合成酶的新鉴定的蛋白片段的组合物、编码所述蛋白片段的多核苷酸及其互补物、相关试剂、及其在诊断、药物发现、研究和治疗应用中的使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术大体涉及包含氨酰-tRNA合成酶和其他蛋白的新鉴定的蛋白片段的组合物，编码它们的多核苷酸及其互补物，相关试剂，及其在诊断、药物发现、研究和治疗应用中的使用方法。
技术介绍
在过去的四十年，氨酰-tRNA合成酶(AARS)被认为是催化tRNA分子氨酰化所必需的管家蛋白，而tRNA分子氨酰化是蛋白翻译过程中遗传信息解码的一部分。AARS在这方面已经得到广泛研究，并且克隆了许多它们的全长序列以进行序列分析并提供生化实验的丰富来源。然而，ー些AARS片段和其他蛋白具有意想不到的与氨酰化无关的活性，包括调节超出蛋白翻译的途径的细胞外信号传导活性。一般而言，在全长或亲本蛋白序列的情况下未发现这些意想不到的活性；反而在从其亲本序列去除或切除AARS蛋白片段之后，或者通过表达并充分纯化AARS片段序列，然后测试新的非合成酶相关的活性，发现了这些活性。虽然AARS的全长序列已经知道了一段时间，但是还没有进行系统的实验分析来阐释此类AARS蛋白片段或来自有关或相关蛋白的蛋白片段，或者评价全长AARS蛋白在氨基酸合成之外的新生物活性方面的潜在作用。在本说明书的多个部分，此类AARS蛋白片段、AARS结构域或AARS选择性剪接变体在本文被称为“切除蛋白(resectin) ”。在其最广的范围内，术语“切除蛋白”指已经从其天然的全长或亲本蛋白序列切离或限制(通过蛋白水解、选择性剪接、诱变或重组基因工程)的一部分蛋白，否则其常常掩盖其新的生物活性。同样，还没有进行系统的实验分析以考察此类切除蛋白在治疗各种医学病症中作为生物治疗剂、诊断剂或药物靶的用途，或者它们与人类疾病的潜在关联。作为具有对哺乳动物生命至关重要的已知功能的必需的管家基因，AARS既没有被考虑作为哺乳动物的药物靶，也没有通过标准的基因组测序、生物信息学或类似工作分析它们以鉴定具有非合成酶活性的切除蛋白。同样， 标准的生化研究工作已经远离鉴定AARS切除蛋白的生物性质及其潜在的治疗和诊断相关性的方向，这主要归因于之前所理解的其相应的全长亲本AARS的作用。附图简述附图说明图1显示与通过质谱分析鉴定的N端AARS多肽的相对位置和大小重叠的精氨酰tRNA合成酶的域结构示意图。图2显示与C端AARS多肽的相对位置和大小重叠的精氨酰tRNA合成酶的域结构示意图。图2A代表通过质谱分析鉴定的的片段，图2B代表通过转录组的深度测序鉴定的片段，以及图2C代表通过生物信息学分析鉴定的片段。图3显示与内部AARS多肽的相对位置和大小重叠的精氨酰tRNA合成酶的域结构示意图。图3A代表通过质谱分析鉴定的的片段，图3B代表通过转录组的深度测序鉴定的片段，以及图3C代表通过生物信息学分析鉴定的片段。专利技术概述本专利技术的实施方案一般涉及氨酰-tRNA合成酶(AARS)的蛋白片段的发现，所述蛋白片段具有非常规的生物活性，例如细胞外信号传导活性，和/或治疗和诊断相关的其他特性。AARS是所有生物中存在的蛋白合成器的通用且必要元件，但是人类AARS及其相关蛋白具有天然存在的切除变体，具有強大的细胞信号传导活性，促进人类的正常功能。这些蛋白片段的活性不同于AARS公知的蛋白合成活性，并且本专利技术包括发现和开发这些切除蛋白作为新治疗剂、新发现研究试剂和定向生物制剂和诊断剂的新抗原/靶，可能用于治疗或诊断许多人类疾病，例如炎性、血液学、神经退行性、自身免疫性、血细胞生成、心血管和代谢疾病或疾患。 因此，本专利技术的AARS蛋白片段可以被称为“切除蛋白”或者“ appendacrine”。如上所述，术语“切除蛋白”源自从其全长亲本AARS序列环境切割或切除给定的AARS蛋白片段的过程，而其全长亲本AARS序列通常掩盖其非常规活性。在某些情况下，本专利技术的AARS蛋白片段和多核苷酸通过该切除过程的发生被鉴定，而不论是天然存在的(例如，蛋白水解的、剪接变体)、人工诱导的还是预测的。术语“appendacrine”衍生自“附加”(来自拉丁语-appender)和“分离”或“分辨”(来自希腊语_ crines)，并且也反映了 AARS蛋白片段的一个或多个附加结构域与其相应的全长或亲本AARS序列分离。尽管之前已经显示几种AARS片段具有非合成酶活性，但是有关生物治疗、发现或诊断功用的此类片段的表达、分离、纯化和表征是有限的，并且本领域技术人员不容易将此类活性与整个AARS家族的每个成员或替代片段相联系。在此，利用了系统的方法发现并证实了用于生物治疗发现和诊断功用的20个线粒体AARS和20个胞质AARS (和相关蛋白)的AARS蛋白片段。例如，使用主要鉴定蛋白水解片段的质谱(MS)从生物样品鉴定了本专利技术的AARS蛋白片段和编码它们的多核苷酸中的某些，并且通过主要鉴定剪接变体的深度测序技术鉴定了其他。使用计算机模拟预测氨基酸序列，例如通过计算机比较来自人类和低等生物的合成酶以及关键区别(例如蛋白酶位点)，鉴定了其他AARS蛋白片段；该方法利用了全长AARS的序列分析，基于分辨具有非常规生物活性的蛋白水解片段和功能结构域的具体标准。AARS的新的切除蛋白是意想不到的，并且它们的差异表达也是意想不到的。特定的切除通常见于不同的处理(例如，从在有或没有血清的培养基中生长的细胞)、不同的生长阶段(例如，成体脑相对于胎儿脑)和不同的组织类型(例如，胰腺相对于肝脏)。尽管在相同的细胞位置以相对比例的量需要所有氨酰tRNA合成酶的常规功能，但所有氨酰tRNA合成酶的表达模式是不同的。人们不会预期ー种氨酰tRNA合成酶活性的水平在其他氨酰tRNA合成酶活性不增加的同时增加。质谱和深度测序数据指示氨酰tRNA合成酶切除蛋白确实具有不同的水平并且出现在不同的部位和不同的阶段。此外，AARS蛋白片段可以被表达和纯化至足够高的纯度以分辨其生物性质。之前，片段常常不具有足够的纯度、折叠和稳定性来实现非合成酶活性的适当的生物表征。例如，配合足够纯的、稳定的、可溶的且折叠的切除蛋白使用基于细胞的測定，以掲示其重要的生物治疗、发现或诊断活性。具体说，本专利技术涉及具有生物治疗、发现或诊断功用的精氨酰tRNA合成酶的蛋白片段，相关试剂和组合物及其使用方法。如本文所描述的，本专利技术的组合物用于许多诊断、药物发现和治疗应用。优选地，AARS蛋白和片段是纯化的并且保存在适合条件下，达到所述生物治疗、发现或诊断用途所需的程度。某些实施方案包括治疗组合物，包含至少约100、90、80、70、60、50或40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3或表4_6或表7-9任一个中所列的氨基酸序列，其中对于基于细胞的非常规生物活性，所述蛋白片段具有约IOnM或更小的EC5tl,并且具有至少约lOmg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度和基本上检测不到水平的内毒素。在具体实施方案中，组合物基本没有血清。測量resectin的这些特征的各种测定在本文中描述，并且可以用于限定本专利技术的方面。在某些方面，这些特征是本文所述的AARS蛋白片段生物治疗用途优选的。 某些实施方案包括组合物，包含至少约100、90、80、70、60、50或40个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.03 US 61/330,790;2010.05.03 US 61/330,778;1.种组合物，包含至少70个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段具有至少约5mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度，小于约IOEU内毒素/mg蛋白，并且基本上没有血清。2.权利要求1所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段包含与选自以下的序列至少90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.29、SEQ.1D.N0.151、和 SEQ.1D.N0.137。3.权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段包含非常规生物活性。4.权利要求3所述的组合物，其中所述非常规生物活性选自:细胞外信号传导的调节、嗜中性粒细胞活化的调节、细胞粘附或趋化的调节、转录的调节、细胞因子生成或活性的调节、炎症的调节、和细胞因子受体活性的调节。5.权利要求4所述的组合物，其中所述非常规生物活性是基因转录的调节。6.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段与异源多肽融合。7.权利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述AARS融合蛋白基本上保持所述AARS蛋白片段的非常规活性。8.权利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非常规活性。9.权利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述异源多肽与所述AARS蛋白片段的N端连接。10.权利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述异源多肽与所述AARS蛋白片段的C端连接。11.权利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述异源多肽选自:纯化标签、表位标签、靶向序列、信号肽、膜易位序列、和PK调节物。12.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含浓度为最少约IOmg/mL的AARS蛋白片段。13.权利要求12所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段是至少90%单分散的。14.权利要求12或13所述的组合物，其中所述组合物包含小于约3%的高分子量聚集蛋白。15.权利要求12至14中任一项所述的组合物，其中所述组合物在4°C下在PBS中以至少lOmg/mL的浓度保存I周时表现出小于3%的聚集。16.种组合物，包含至少70个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段与表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸的置換、缺失和/或添加，其中改变的蛋白片段基本上保持未改变的蛋白的非常规活性，其中所述蛋白片段具有至少约lOmg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度，小于约IOEU内毒素/mg蛋白，并且基本上没有血清污染。17.种组合物，包含特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的分离的抗体，其中所述抗体对所述AARS蛋白片段的亲和カ比所述抗体对相应的全长AARS多肽的亲和カ强约10X，并且其中所述抗体拮抗所述AARS蛋白片段的非常规活性。18.种组合物，包含特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的分离的抗体，其中所述抗体具有至少约IOnM的对所述AARS蛋白片段的亲和力，和至少约IOOnM的对相应全长AARS多肽的亲和力。19.权利要求17或18中任一项所述的组合物，其中所述抗体结合位于表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的AARS多肽独特剪接点内的表位，或者结合该剪接位点的C端氨基酸序列。20.权利要求17或18中任一项所述的组合物，其中所述抗体结合包含选自SEQ.1D.N0.26和SEQ.1D.N0.28的至少5个连续氨基酸的表位。21.权利要求17或18中任一项所述的组合物，其拮抗所述AARS多肽的非常规活性。22.种生物测定系统，包含至少70个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段和结合所述AARS蛋白片段的结合伴侶，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列。23.权利要求22所述的生物測定系统，其中所述结合伴侣选自:细胞表面受体蛋白、核酸、脂质膜、细胞调节蛋白、酶和转录因子。24.权利要求22所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段包含与选自以下的序列至少90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.29、SEQ.1D.N0.151、和 SEQ.1D.N0.137。25.种细胞组合物，包含:至少70 个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列；和工程化的细胞群，其中至少ー个细胞包含编码所述AARS蛋白片段的多核苷酸，其中所述细胞能够在无血清培养基中生长。26.种检测系统，包含:至少70个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列；包含结合所述蛋白片段的细胞表面受体或其细胞外部分的细胞；和调节所述AARS蛋白片段和细胞外受体的结合或相互作用的小于约2000道尔顿的分子或第二多肽。27.种诊断系统，包含:至少70个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列；和包含特异性结合所述AARS蛋白片段的细胞表面受体或其细胞外部分的细胞，其中所述细胞包含指示分子，所述指示分子允许检测所述细胞表面受体或其细胞外部分的水平或活性的变化。28.种细胞生长装置，包含:至少70个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列；工程化的细胞群，其中至少ー个细胞包含编码所述AARS蛋白片段的多核苷酸；至少约10升的无血清生长培养基；和无菌容器。29.种反义或RNA干扰(RNAi)剂，包含靶向对抗表1_3、或表4_6、或表7_9任ー个中所列的AARS剪接变体的独特剪接点的序列。30.种治疗组合物，包含至少70个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段特异性结合结合伴侶以发挥生理效应并且具有至少约5mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度和小于约IOEU内毒素/mg蛋白。31.权利要求29所述的治疗组合物，其中所述AARS蛋白片段包含与选自以下的序列至少 90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.29、SEQ.1D.N0.151、和 SEQ.1D.N0.137。32.权利要求29或30所述的治疗组合物，其中所述结合伴侣选自:细胞表面受体、核酸、脂质膜、调节蛋白、酶和转录因子。33.权利要求29或30所述的治疗组合物，其中所述AARS蛋白片段与异源多肽融合。34.权利要求32所述的治疗组合物，其中所述AARS融合蛋白基本上保持所述AARS蛋白片段的非常规活性。35.权利要求32所述的治疗组合物，其中所述AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非常规活性。36.权利要求32所述的治疗组合物，其中所述异源多肽与所述AARS蛋白片段的N端连接。37.权利要求32所述的治疗组合物，其中所述异源多肽与所述AARS蛋白片段的C端连接。38.权利要求32所述的治疗组合物，其中所述异源多肽选自:纯化标签、表位标签、靶向序列、信号肽、膜易位序列、和PK调节物。39.权利要求29-30中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物包含浓度为最少约lOmg/mL的AARS蛋白片段。40.权利要求29-30中任一项所述的治疗组合物，其中所述AARS蛋白片段是至少90%单分散的。41.权利要求39所述的治疗组合物，其中所述组合物包含小于约3%的高分子量聚集蛋白。42.权利要求39所述的治疗组合物，其中所述组合物在4°C下在PBS中以至少IOmg/mL的浓度保存I周时表现出小于3%的聚集。43.种组合物，包含至少70个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段与表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一，其中所述蛋白片段具有至少约5mg/mL的溶解度，并且其中所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度和小于约IOEU内毒素/mg蛋白。44.种组合物，包含至少70个氨基酸的基本上纯的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段和至少ー个与之共价或非共价连接的部分，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列。45.权利要求42所述的组合物，其中所述AARS蛋白片段包含与选自以下的序列至少90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.29、SEQ.1D.N0.151、和 SEQ.1D.N0.137。46.权利要求42或43所述的组合物，其中所述部分是可检测的标记物。47.权利要求42或43所述的组合物，其中所述部分是水溶性聚合物。48.权利要求42或43所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。49.利要求42或43所述的组合物，其中所述部分与所述蛋白片段的N端连接。50.权利要求42或43所述的组合物，其中所述部分与所述蛋白片段的C端连接。51.种组合物，包含与至少70个氨基酸的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段连接的固体基底，所述蛋白片段包含表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段具有至少约5mg/mL的溶解度，并且所述组合物以蛋白基计具有至少约95%的纯度。52.种组合物，包含特异性结合表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的结合剂，其中所述结合剂具有至少约1nM的对所述蛋白片段的亲和力。53.权利要求52所述的组合物，其中所述结合剂结合位于表1-3、或表4-6、或表7-9任一个中所列的AARS多肽独特剪接点内的表位，或者结合该剪接位点的C端氨基酸序列。54.权利要求52所述的组合物，其中所述结合剂结合包含选自SEQ.ID.N0.26和SEQ.ID.N0.28的至少5个连续氨基酸的表位。55.权利要求52所述的组合物，其拮抗所述AARS多肽的非常规活性。56.种分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，包含表1_3、或表4_6、或表7_9任ー个中所列的AARS蛋白片段的氨基酸序列。57.权利要求56所述的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，其中所述AARS多肽包含选自以下的氨基酸序列:SEQ.ID.N0.29、SEQ.ID.N0.151、和 SEQ.ID.N0.137。58.种分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，包含与表1_3、或表4_6、或表7_9任一个中的序列至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一的氨基酸序列。59.权利要求58所述的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，其中所述AARS多肽选自:SEQ.ID.N0.29、SEQ.ID.N0.151、和 SEQ.ID.N0.137。60.种分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，基本上由与表1_3、或表4_6、或表7_9任一个中的序列至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一的氨基酸序列组成。61.权利要求60所述的分离的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，其中所述AARS多肽选自:SEQ.ID.N0.29、SEQ.ID.N0.151、和 SEQ.ID.N0.137。62.权利要求61所述的多肽，其中所述多肽包含非常规生物活性。63...

【专利技术属性】
技术研发人员：莱斯利·安·格林尼，凯尔·P·基昂格，洪非，阿兰·P·瓦瑟洛特，罗咏诗，杰弗里·D·沃特金斯，约翰·D·门德莱恩，谢丽尔·L·奎恩，
申请(专利权)人：ATYR医药公司，盘古生物制药有限公司，
类型：
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