抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法，通过合成M.Barkeri的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pPICZ质粒上；通过设计抗HBsAg抗体的突变DNA序列，将所述突变DNA与质粒pPIC9K重组，获得pPIC9K-antiHBsAg；通过将线性化质粒pPICZ-CouKRS、pPIC9K-antiHBsAg电击转化、筛选和验证，获得了制备抗乙肝表面抗原荧光抗体的真核生物表达系统，从而实现了抗乙肝表面抗原荧光抗体的制备。本发明专利技术抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法提高了HBsAg检测的灵敏度，加强了对乙肝发病的监控力度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方 法。
技术介绍
乙型病毒性肝炎（简称乙型肝炎)是由乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引 起的全球性重大公共卫生问题，也是最常见的肝病病因。据世界卫生组织统计，全球有20亿 人曾感染过HBV，其中约有3亿人发展成为HBV慢性感染者。HBV慢性感染是导致肝硬化和肝 癌的主要原因，世界上约有1/3的肝硬化患者和3/4以上的肝癌患者是由乙型肝炎慢性感染 所致。每年有近100万人死于HBV慢性感染引起的肝硬化或肝癌等疾病。中国是HBV感染的高 发地区，目前中国有9300万HBV慢性感染人群。近年来，随着乙肝疫苗的推广，新发乙型肝炎 数量减少，但中国每年仍有10万例新发HBV感染者。乙型肝炎防控的难度不容忽视。乙肝表 面抗原(HBsAg)定量检测是评价慢乙肝治疗效果的重要手段。中华医学会发布的2015年版 《慢性乙型肝炎防治指南》指出：对血清中的乙肝表面抗原进行定量监测，可用于预测疾病 进展、抗病毒疗效和预后，停药后获得持久的HBsAg消失为慢乙肝治疗的理想终点。欲评估 慢乙肝HBsAg是否消失，则要求对HBsAg的定量达到精确的水准。受技术所限，HBsAg的检测 一直处于手工定性或者半定量状态。最近，国外的公司有通过化学显色的方法来定量 HBsAg，然而化学显色方法灵敏度滴，检测不到血液中低丰度的HBsAg，会给HBsAg的检测带 来误判。荧光发光检测的方法比化学显色灵敏10000倍以上，可以检测到样本中单个拷贝的 靶标的检测。 基于此，有必要设计一种，用来大幅度提 高HBsAg检测的灵敏度，实现HBsAg的精确定量检测，辅助加强对乙型肝炎的发病的监控力 度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，旨在提高 HBsAg的检测灵敏度、性质稳定性和特异性，适用于HBsAg的精确定量检测。 为实现上述目的，本专利技术提供一种，所述 包括如下步骤： 51:获得183冰64?711?突变库； S2:获得香豆素赖氨酸； S3:筛选特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(CouKRS)突变体； S4:将步骤S3中的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体的编码基因 coukrs与毕赤 酵母表达质粒pPICZ重组，获得酵母表达质粒pPICZ-CouKRS; S5:设计抗HBsAg抗体的突变DNA序列，获得该突变体，将所述抗HBsAg抗体的突变 DNA序列与质粒pPIC9K重组，获得酵母表达质粒PPIC9K-antiHBsAg; S6:将步骤S4获得的pPICZ-CouKRS线性化，将步骤S5获得的PPIC9K-antiHBsAg线 性化； S7:将步骤S6线性化后的pPICZ-CouKRS和线性化后的pPIC9K-antiHBsAg按照第一 预设的比例混合，经过电击转化，导入到毕赤酵母X33中，获得菌株A; S8:将步骤S7获得的菌株A进行抗性筛选，获得阳性菌株组B; S9:将步骤S8获得的阳性菌株组B分别进行PCR筛选鉴定，获得若干个阳性菌株组 C； S10:将步骤S9获得的阳性菌株组C中的单克隆酵母，涂布于含有G418的YPDS固体 培养基中培养，以验证所述单克隆酵母的G418抗性，若验证成功，则获得具备识别并携带7-羟基香豆素插入到抗乙肝表面抗原抗体的63位点的单克隆酵母D; S11:将步骤S10获得的单克隆酵母D扩大培养、离心、超声破碎以及镍柱纯化得到 抗乙肝表面抗原荧光抗体。 优选地，所述步骤S1包括如下步骤： 5101:人工合成18&吐64?711?的0嫩序列； S102:将上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，获得重组质粒 A； S103:设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-Y349D、引物r-Y349D、引 物f-L2701、引物r-L2701、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物 Γ-Υ349ΝΝΚ； S104:以所述重组质粒A为模板，以所述引物f-Y349D和引物r-Y349D为引物，通过 聚合酶链式反应，获得突变库1; S105:以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270I和引物r-L270I为引物，通过聚 合酶链式反应，获得突变库2; S106:以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为 引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3; S107:以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK为引物，通 过聚合酶链式反应，获得突变库4; S108:所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预定的比例混合，获得 用于7-羟基香豆素筛选用的M.Barkeri PylRS突变库。优选地，所述第一预定的比例为1:1。优选地，所述步骤S2包括如下步骤： S21:取第一预设量的间苯二酚，溶于水中，并加热到90°C，滴加第二预设量的苹果 酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素 A; S22:取第三预设量的上述7-羟基香豆素 A、赖氨酸和LiCl水溶液于60°C搅拌，经过 12小时;经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到7-羟基香豆素母液C。 优选地，所述7-羟基香豆素母液C经过0.22微米滤膜过滤除菌。 优选地，所述7-羟基香豆素母液C的浓度设定为100mM。 优选地，所述步骤S8包括如下步骤： S81:将步骤S7获得的菌株A培养两个小时后涂布在含ZeocinTM和氨苄霉素的YPDS 平板上，30°C培养3天，获得多个单克隆菌株； S82:将步骤S81获得的多个单克隆菌株挑取到YPD液体培养基中，30°C摇床培养。 获得阳性菌株组B 优选地，所述步骤S9包括如下步骤： S91:取步骤S82获得的阳性菌株组B扩增的酵母菌液分别置于离心管中离心，获得 酵母沉淀组1; S92:将步骤S91获得的酵母沉淀组1加入无菌水，漩涡震荡重悬，获得酵母沉淀组 2； S93:将所述酵母沉淀组2分别置于-80°C的冰箱，30min后取出，室温下融化； S94:重复步骤S93-次，分别离心取上清液获得酵母溶液组3; S95:取酵母溶液组3，分别置于PCR扩增仪上进行PCR扩增，验证步骤S82中的单克 隆的正确性，获得若干个阳性菌株组C。 优选地，所述步骤S4在毕赤酵母表达质粒pPICZ的EcoRI和Xbal酶切位点之间插入 吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体的编码基因 coukrs，获得酵母表达质粒pPICZ-CouKRS。 优选地，所述步骤S5在质粒pPIC9K的EcoRI和Notl酶切位点之间插入抗HBsAg抗体 的突变DNA序列，获得酵母表达质粒pPIC9K-antiHBsAg。 本专利技术提供的通过合成M. Barker i物种的 吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pPICZ质粒上;通 过设计抗HBsAg抗体的突变DNA序列，获得该突变体，将所述抗HBsAg抗体的突变DNA与质粒 PPIC9K重组，获得酵母表达质粒pPIC9K-antiHBsAg;通过将线性化质粒pPICZ-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法包括如下步骤：S1：获得M.Barkeri PylRS突变库；S2：获得香豆素赖氨酸；S3：筛选特异识别7‑羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰‑tRNA合成酶(CouKRS)突变体；S4：将步骤S3中的吡咯赖氨酸氨酰‑tRNA合成酶突变体的编码基因coukrs与毕赤酵母表达质粒pPICZ重组，获得酵母表达质粒pPICZ‑CouKRS；S5：设计抗HBsAg抗体的突变DNA序列，获得该突变体，将所述抗HBsAg抗体的突变DNA序列与质粒pPIC9K重组，获得酵母表达质粒pPIC9K‑antiHBsAg；S6：将步骤S4获得的pPICZ‑CouKRS线性化，将步骤S5获得的pPIC9K‑antiHBsAg线性化；S7：将步骤S6线性化后的pPICZ‑CouKRS和线性化后的pPIC9K‑antiHBsAg按照第一预设的比例混合，经过电击转化，导入到毕赤酵母X33中，获得菌株A；S8：将步骤S7获得的菌株A进行抗性筛选，获得阳性菌株组B；S9：将步骤S8获得的阳性菌株组B分别进行PCR筛选鉴定，获得若干个阳性菌株组C；S10：将步骤S9获得的阳性菌株组C中的单克隆酵母涂布于含有G418的YPDS固体培养基中培养，以验证所述单克隆酵母的G418抗性，若验证成功，则获得具备识别并携带7‑羟基香豆素插入到抗乙肝表面抗原抗体的63位点的单克隆酵母D；S11：将步骤S10获得的单克隆酵母D扩大培养、离心、超声破碎以及镍柱纯化得到抗乙肝表面抗原荧光抗体。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张贯京，陈兴明，张少鹏，高伟明，李慧玲，
申请(专利权)人：深圳市贝沃德克生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44