本发明专利技术公开了一种N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(L-NCC酰胺水解酶)的基因序列及其重组表达蛋白质的制备及应用。本发明专利技术所提供的来源于假单胞菌（保藏号CGMCCNo.5315）的L-NCC酰胺水解酶是序列表中SEQIDNo.1的氨基酸残基序列或将SEQIDNo.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代、缺失或添加具有与SEQIDNo.1相同活性的由SEQIDNo.1衍生的蛋白质。本发明专利技术将来源于假单胞菌L-NCC酰胺水解酶基因克隆并表达制备重组酶，可用于生物法水解N-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-NCC)获得L-半胱氨酸，所以可以用于酶法生产L-半胱氨酸。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及来源于假单胞菌的一种L-NCC酰胺水解酶的编码基因，以及重组蛋白质的表达与应用。
技术介绍
N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(N-carbomyl-L-cysteine amidohydrolase)， 即L-NCC酰胺水解酶，是一种催化N-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamyl-L-cysteine， L-NCC)水解生成L-半胱氨酸的酶。因为ATC消旋酶催化拆分DL-ATC生成L-ATC ；L-ATC水解酶水解ATC噻唑环中C-S单键，生成中间产物L-NCC ；再经L-NCC酰胺水解酶催化生成终产物L-半胱氨酸，所以L-NCC酰胺水解酶是参与酶法转化DL-ATC生产L-半胱氨酸的重要成员之一，具体过程参见附图1。L-半胱氨酸(L-cysteine)是组成蛋白质的20种氨基酸之一，是一种α氨基酸， 它的存在可以保持蛋白质的稳定性，同一条或不同多肽链两个L-半胱氨酸残基间以二硫键(-S-S-)连接，使蛋白质具有稳定的空间立体结构。L-半胱氨酸在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有广泛的用途，日益受到重视。目前L-半胱氨酸的生产方法主要有毛发水解后还原法、化学合成法、发酵法和酶法合成法等。近年来，以微生物为酶源，采用酶法制备氨基酸的技术有了快速的发展。微生物酶法具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物少等优点。特别是近年来，以酶法合成替代难于用发酵法生产的氨基酸，有了显著的进步。目前，有3种微生物酶法转化合成L-半胱氨酸的工艺路线(1)以3-氯-L-丙氨酸为前体物的L-半胱氨酸酶法合成；(2)以0-乙酰丝氨酸为前体物的酶法合成L-半胱氨酸；(3)以 DL-ATC为前体物的酶法生产L-半胱氨酸。DL-ATC是以丙烯酸甲酯为前体物合成的化工产品。对DL-ATC酶法合成L-半胱氨酸转化途径的研究最早开始于1979年，日本学者Sano提出了完成该转化过程的两种假设 一种是以S-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamyl-L-cysteine，L-SCC)为中间产物的S-代途径；另一种是以L-NCC为中间产物的N-代途径，反应过程和酶系如附图1所示。其中以 L-NCC为中间产物的转化途径最初于1998年由Tamura报道。该学者对L-半胱氨酸合成菌株假单胞菌ON-如和恶臭假单胞菌AJ3865进行研究，诱导实验发现，如果分别以DL-ATC、 L-NCC和L-SCC为诱导物进行细胞培养，诱导后的细胞加入不同的底物进行酶活测定，仅 DL-ATC诱导后的细胞具有L-ATC水解酶活性；而且各种细胞均有L-NCC酰胺水解酶活性而无L-SCC酰胺水解酶活性，而且各种细胞均不能够利用N-氨甲酰-D-半胱氨酸、L-SCC和 S-氨甲酰-D-半胱氨酸为底物进行酶促反应生成L-半胱氨酸。Tamura还对中间产物进行了纯化，纯化后的产物经过红外光谱扫描、质谱分析、核磁共振分析和元素分析，结果与标准的L-NCC完全相同，因此证明了这两株菌进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢途径。目前，有关酶法合成L-半胱氨酸相关酶系的报道不多。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的L-NCC酰胺水解酶及其编码基因，获得活力较高的重组酶，并且这种L-NCC酰胺水解酶可在酶法制备L-半胱氨酸中应用。本专利技术从污泥中分离得到了一株新的假单胞菌I^seudomonas sp. QR-101，于2011 年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No. 5315。该菌株进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢途径，涉及ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶等3个酶的协同催化作用。本专利技术提供的L-NCC酰胺水解酶，来源于假单胞菌I^seudomonas sp. QR-101，是序列表中SEQ ID No. 1的氨基酸残基序列或将SEQ ID No. 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代或添加且具有与SEQ ID No. 1相同活性的由SEQ ID No. 1衍生的蛋白质。序列表中SEQ ID No. 1的氨基酸残基序列是由420个氨基酸残基组成的蛋白质。本专利技术所提供的L-NCC酰胺水解酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一(1)是序列表SEQ ID No. 2的核苷酸序列，由1260个碱基组成；(2)编码序列表中SEQ ID No. 1蛋白质序列的多核苷酸序列。本专利技术同时提供了含本专利技术基因(SEQ ID No. 2)的表达载体及细胞体系。所述的细胞体系为原核细胞系统。本专利技术重组L-NCC酰胺水解酶蛋白质可以通过以下方法获得培养含有L-NCC酰胺水解酶表达载体的宿主菌E. C0liBL21/pET-21a(+)-atCC，该细胞体系为原核细胞体系， 在所规定的蛋白质表达条件下，获得表达产物L-NCC酰胺水解酶。本专利技术的L-NCC酰胺水解酶及其编码基因可在微生物酶法生产L-半胱氨酸中应用。本专利技术的有益效果本专利技术从一株假单胞菌中成功地克隆到一个新的L-NCC酰胺水解酶基因并进行了表达、重组酶的制备和转化等研究，本专利技术涉及的L-NCC酰胺水解酶的氨基酸序列通过 GenBank Blast 发现，与来自 Pseudomonas sp. Strain BS 的 atcC (GenBank :BAD15360. 1)的同源性为88%，它们的核苷酸序列同源性为83%。利用高效表达L-NCC酰胺水解酶的大肠杆菌E. coliBL21/pET-21a (+) -atcC,水解L-NCC生产L-半胱氨酸，催化效率高，发酵成本低，且反应液中成分单一，后续分离纯化方便，因此本专利技术在L-半胱氨酸和L-胱氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化价值。附图说明图1 是酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的S-代和N-代途径示意图；图2 是I^seudomonas sp. QR-101的L-NCC酰胺水解酶与数据库中已知序列L-NCC 酰胺水解酶(GenBank :BAD15360. 1)的核苷酸序列比对，其中，A是基因序列的l_640bp，B 是基因序列的641-1260bp ；图3 是重组质粒pET21-a(+)/atCC的图谱；4图4 是基因工程菌E. coliBL21/pET-21a(+)-atcC的酶切鉴定图；图 5:是基因工程菌 E. coliBL21/pET-21a(+)_atcC 表达蛋白的 SDS-PAGE 电泳图。其中，泳道1 :Pseudomonas sp. QR-101 ；泳道2 基因工程菌Ε· coli BL21/ pET-21a(+)-atcC ；泳道 3 :Ε· coli BL21/pET_21a(+)。图6 是酶催化L-NCC生成L-半胱氨酸的薄层层析图谱。其中，第1道L_NCC标准品；第2道L-半胱氨酸标准品；第3道酶催化反应液。具体实施例方式实施例1L-NCC酰胺水解酶的酶活测定方法(1)原理采用酸性茚三酮法。L-NCC酰胺水解酶分解L-NCC生成L-半胱氨酸， L-半胱氨酸在煮沸的条件下与酸性茚三酮试剂生成红色物质，在560nm下有最大吸收，其颜色深浅与L-半胱氨酸的量成正比。(2)方法准确在10A的L本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高智慧，刘磊，姚瑞娟，王文芳，
申请(专利权)人：天津启仁医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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