本发明专利技术公开了一种调节PI3K‑AKT信号通路的非编码基因的筛选系统及筛选方法，该筛选系统包括①和②，或者①和③：①报告系统或包含报告系统的重组载体；②gRNA文库或gRNA载体文库；③双gRNA文库或双gRNA载体文库。本发明专利技术利用基于CRISPR/dCas9构建的gRNA载体文库激活非编码基因的转录表达、利用基于CRISPR/hCas9构建的双gRNA载体文库抑制非编码基因的转录表达，并利用报告系统相对容易地筛选出能够调节PI3K‑AKT信号通路的有效非编码基因，从而进一步了解非编码基因的生物学功能，为调节PI3K‑AKT信号通路提供新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种调节PI3K-AKT信号通路的非编码基因的筛选系统及筛选方法。
技术介绍
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)信号参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，近年来发现，IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶B(PKB或AKT)所组成的信号通路与人类肿瘤以及其他疾病的发生发展密切相关。该信号通路调节肿瘤细胞的增殖和存活，其活性异常不仅能导致细胞恶性转化，而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关，目前以PI3K-AKT信号通路关键分子为靶点的肿瘤治疗策略正在发展中。AKT的失调还与心脏肥大有关：AKT直接靶向糖原合酶激酶-3(GSK-3)β，磷酸NFAT蛋白质，在调节完整心肌的肥大信号中，通过刺激NFAT核出口调节拮抗神经钙的行动。此外，AKT还参与糖尿病的发生，AKT信号的失调可导致胰岛素抗性的发展。AKT/mTOR信号通路也在神经退行性疾病中发挥作用。IA型PI3K是由催化亚单位p110和调节亚单位p85所组成的二聚体蛋白,具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性。PI3K通过两种方式激活：一种是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用，引起二聚体构象改变而被激活；另一种是通过Ras和p110直接结合导致PI3K的活化。PI3K激活的结果是在质膜上产生第二信使PIP3，PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDK(phosphoinositidedependentkinase-1)结合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308导致AKT的活化。AKT还能通过PDK2(如整合素连接激酶ILK)对其Thr473的磷酸化而被激活，活化的AKT通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、MDM2/p53、Foxo、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27Kip1等，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等。PI3K-AKT信号通路的活性还会被类脂磷酸酶PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)和SHIP(SH2-containing inositol 5-phosphatase)负调节，PTEN和SHIP分别从PIP3的3′和5′去除磷酸，从而将PIP3转变成PI(4,5)P2和PI(3,4)P2而降解。众所周知，蛋白质编码基因的转录只占全基因组转录的大约2％，其余的转录则均为非编码RNA如microRNA和lncRNA的转录，越来越多的研究表明，非编码RNA也通过多种方式参与调节PI3K-AKT信号通路，例如miR-21和miR-101可以通过直接或间接靶向PTEN，使PTEN失去活性，进而促使AKT活化；NF-κB的活化需要MALAT1参与；miR-145、Loc285194、Linc-RoR等参与了p53的基因调控，等等。非编码RNA的数量众多，其中，到目前为止，已经有超过50,000的lncRNA被发现，这比蛋白质编码基因的数量要多得多，这也为我们人类基因组的复杂性提供了进一步证据。lncRNA是新型癌症生物标志物或治疗靶点的丰富来源，而且绝大部分lncRNA的生物学功能还是未知，对lncRNA进行功能性研究非常重要。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于筛选调节PI3K-AKT信号通路的非编码基因的报告系统，该报告系统能简便地筛选出能够激活或抑制PI3K-AKT信号通路的非编码基因。一种用于筛选调节PI3K-AKT信号通路的非编码基因的报告系统，该报告系统包括第一基因表达框和第二基因表达框，所述第一基因表达框包括依次相连的AKT靶标应答元件、第一启动子和Tet阻遏因子序列，所述第二基因表达框包括依次相连的Tet操纵因子序列和报告基因。PI3K-AKT信号通路中，活化的AKT能够通过自磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白(即AKT靶标)，当AKT靶标被激活时，AKT靶标能够与本专利技术报告系统中的AKT靶标应答元件结合，从而驱使RNA聚合酶与第一启动子结合，开启Tet阻遏因子序列(即Tet阻遏因子的编码DNA)的表达，表达的Tet阻遏因子能够与Tet操纵因子序列(即Tet操纵因子的编码DNA)结合，抑制报告基因的表达；反之，当AKT被抑制或AKT靶标被抑制时，AKT靶标难以与本专利技术报告系统中的AKT靶标应答元件结合，Tet阻遏因子因表达量低而难以结合Tet操纵因子序列，使得报告基因高表达。如此，通过激活细胞中的非编码基因(如利用SAM文库)或抑制细胞中(如利用KO文库)，并比较非编码基因被激活前后报告基因的表达水平，即可简便地了解该非编码基因对PI3K-AKT信号通路是否存在调节作用，并筛选出能激活或抑制PI3K-AKT信号通路的非编码基因。本专利技术中，所述AKT靶标可以是目前为本领域技术人员所熟知的各个AKT下游靶蛋白，如Bad、Caspase9、NF-κB、MDM2/p53、Foxo、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27Kip1等。本专利技术中，AKT靶标应答元件的拷贝数可以根据具体需要自由设置。本专利技术中，第一启动子可以是完整的真核基因启动子(如RNA聚合酶II启动子)，也可以是真核基因启动子的核心启动子元件，也可以是核心启动子元件中的TATA盒。作为优选，所述报告基因为抗性基因、荧光蛋白基因中的至少一种。作为优选，所述报告基因包括第一基因表达框和第二基因表达框，所述第一基因表达框由依次相连的AKT靶标应答元件、TATA盒、Tet阻遏因子和KRAB结构域序列(即KRAB结构域的编码DNA)组成，所述第二基因表达框由依次相连的Tet操纵因子和报告基因组成。本专利技术还提供了包含所述报告系统的重组载体。本专利技术还提供了一种调节PI3K-AKT信号通路的非编码基因的筛选系统，该筛选系统包括以下①和②，或者包括以下①和③：①所述报告系统，或包含所述报告系统的重组载体；②gRNA文库，或由所述gRNA文库与载体连接而成的gRNA载体文库；所述gRNA文库包括针对待筛选非编码基因的多个gRNA(即singleguide RNA)，每一gRNA均靶向待筛选非编码基因的启动子区域(该启动子区域一般是非编码基因第一个外显子上游～1kb的区域)；③双gRNA文库，或由所述双gRNA文库与载体连接而成的双gRNA载体文库；所述双gRNA文库包括针对待筛选非编码基因的多个双gRNA，每一双gRNA均由依次相连的第二启动子、gRNA-a序列(即gRNA-a的编码基因)、crRNA支架序列、第三启动子和gRNA-b序列(即gRNA-b的编码基因)组成；同一双gRNA转录的gRNA-a和gRNA-b分别与同一待筛选非编码基因上的两个靶位点互补配对，不同双gRNA转录的gRNA-a和gRNA-b中有至少一个互不相同。作为优选，所述第二启动子和第三启动子为互不相同的聚合酶III启动子，如H1启动子或U6启动子。gRNA文库或gRNA载体文库用于激活细胞中的非编码基因，而双gRNA文库或双gRNA载体文库则用于敲除细胞中的非编码基因。因此当采用含有gRNA文库的筛选系统时，该筛选系统宜与dCas9联用；当采用含有双gRNA文库的的筛本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于筛选调节PI3K‑AKT信号通路的非编码基因的报告系统，其特征在于，包括第一基因表达框和第二基因表达框，所述第一基因表达框包括依次相连的AKT靶标应答元件、第一启动子和Tet阻遏因子序列，所述第二基因表达框包括依次相连的Tet操纵因子序列和报告基因。
【技术特征摘要】
1.一种用于筛选调节PI3K-AKT信号通路的非编码基因的报告系统，其特征在于，包括第一基因表达框和第二基因表达框，所述第一基因表达框包括依次相连的AKT靶标应答元件、第一启动子和Tet阻遏因子序列，所述第二基因表达框包括依次相连的Tet操纵因子序列和报告基因。2.如权利要求1所述的报告系统，其特征在于，所述第一启动子为真核基因启动子的核心启动子元件。3.如权利要求1所述的报告系统，其特征在于，所述第一启动子为TATA盒。4.如权利要求1所述的报告系统，其特征在于，所述报告基因为抗性基因和荧光蛋白基因中的至少一种。5.如权利要求1所述的报告系统，其特征在于，包包括第一基因表达框和第二基因表达框，所述第一基因表达框由依次相连的AKT靶标应答元件、TATA盒、Tet阻遏因子和KRAB结构域序列组成，所述第二基因表达框由依次相连的Tet操纵因子和报告基因组成。6.包含如权利要求1～5任一所述的报告系统的重组载体。7.一种调节PI3K-AKT信号通路的非编码基因的筛选系统，其特征在于，包括以下①和②，或者包括以下①和③：①如权利要求1～5任一所述的报告系统，或包含所述报告系统的重组载体；②gRNA文库，或由所述gRNA文库与载体连接而成的gRNA载体文库；所述gRNA文库包括针对待筛选非编码基因的多个gRNA，每一gRNA均靶向待筛选非编码基因的启动子区域；③双gRNA文库，或由所述双gRNA文库与载体连接而成的双gRNA载体文库；所述双gRNA文库包括针对待筛选非编码基因的多个双gRNA，每一双gRNA均由依次相连的第二启动子、gRNA-a序列、crRNA支架序列、第三启动子和gRNA-b序列组成；同一双gRN...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁先锋，莫寅元，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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