来自原生动物阴道毛滴虫的高半胱氨酸脱硫酶制造技术

一种测定样品中的高半胱氨酸的方法，包括下列步骤： ａ）将样品与能降解高半胱氨酸的酶接触，和 ｂ）测定由所述酶对高半胱氨酸进行酶促降解所形成的任何反应产物。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用一种催化高半胱氨酸，半胱氨酸，邻乙酰-L-丝氨酸和/或甲硫氨酸降解的酶，该酶具体地说是高半胱氨酸脱硫酶，来测定生物学样品中高半胱氨酸，半胱氨酸，邻乙酰-L-丝氨酸和/或甲硫氨酸水平的测定法，还涉及编码原生动物高半胱氨酸脱硫酶的多核苷酸片断，包含该多核苷酸片断的重组载体，含有所述多核苷酸片断或所述重组载体的转化细胞，原生动物高半胱氨酸脱硫酶多肽和用于医学或兽医学的含有重组高半胱氨酸脱硫酶的药用组合物。血液中高半胱氨酸水平的升高似乎是许多人类疾病状态的重要指示物。高半胱氨酸是血管疾病和中风的征兆，Ueland,P.M.(1992)和Kluiitmans L.A.J.等(1996)；与糖尿病的形式和醇中毒相关，Cravo,M.L.等(1996)；用于监测肝脏和肾脏损伤，Bostom,A.G.等(1996)和神经管缺陷，Steegers-Theunissen,R.P.N.(1992)并与代谢的某些先天错误相联系，Mudd,S.H.,(1989)。血液中高半胱氨酸的水平按常规使用高效液相色谱(HPLC)方法测定，参见例如Poele-Pothoff M.T.B.等(1995)。然而，HPLC方法采用了昂贵而费力的机器，一般很复杂且据认为对于许多常规分析是不实际的。专利公开WO93/15220(Cockbain)描述了使用高半胱氨酸转化酶，S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH-水解酶)测定血液中的高半胱氨酸的方法。SAH-水解酶催化高半胱氨酸与共同底物，腺苷转变为S-腺苷-高半胱氨酸。然后经过测定消耗的腺苷量可与消耗的高半胱氨酸量相关联。然后从腺苷浓度差测定样品中高半胱氨酸的量。然而，这种测定需要使用两种起始底物(高半胱氨酸和腺苷)和两种酶，使其相当复杂。它还涉及测定腺苷浓度的下降，可能不尽人意。US4940658(Allen等)描述了一种测定身体组织样品中巯基氨基酸，包括高半胱氨酸水平的方法，使用对总高半胱氨酸水平的测定来检测钴胺素和叶酸缺乏的方法，和使用对总高半胱氨酸水平的测定结合对甲基丙二酸的测定来区分钴胺素与叶酸缺乏的方法。该测定包括将样品与含有用合适标记物标记的待测已知量的巯基氨基酸的参照标准结合并用质谱仪测量各种类存在的标记和未标记的巯基氨基酸的相对量。由于标记种类的量是已知的，因此可计算标记与未标记种类的比率以测定在样品中存在的巯基氨基酸的量。US5438017描述了一种用于分析体液样品中的巯基氨基酸的气相色谱/质谱分析法。该测定依赖于使用标记的参照巯基氨基酸，相似于在US4940658中所述，但在经气相色谱/质谱分析法分析样品前需要另外的处理和/或纯化步骤。可以预期的是与HPLC方法相似，采用气相色谱/质谱分析法的上述测定一般较为复杂，需使用昂贵和费力的机器且据认为对于许多常规分析是不实际的。本专利技术的一个目的是提供一种避免和/或减轻至少一些上述缺陷的测定方法。本专利技术的另一目的是提供能催化包括用于所述测定的高半胱氨酸降解的重组酶。本专利技术提供了编码原生动物高半胱氨酸脱硫酶的多核苷酸片断，如DNA片断。本专利技术进一步提供了一种重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶多肽。本文所用的“高半胱氨酸脱硫酶”指能催化高半胱氨酸降解以释放α-丁酮酸，硫化氢，和氨的酶。这种酶也可具有对诸如甲硫氨酸，半胱氨酸和邻乙酰基-L-丝氨酸的其它底物的亲和性。例如，如果甲硫氨酸用作底物，则该酶的代谢终产物是α-丁酮酸，氨和甲硫醇。应预料到的是可以有一些形式(例如，来自不同生物)或同工型的“高半胱氨酸脱硫酶”且本文包括所有这些形式/同工型及其应用。本文使用的“多核苷酸片断”指能产生高半胱氨酸脱硫酶或其生理学功能性衍生物的诸如脱氧核糖核酸(DNA)序列的核苷酸链和诸如RNA的其转录产物。生理学功能性衍生物是以酶功能性将该酶鉴定为上文所定义的高半胱氨酸脱硫酶的一种衍生物。因此，该术语包括双链和单链DNA和从其产生的RNA序列。该术语排除了包括例如，在原生动物Trichomonas vaginalis中发现的该多核苷酸片断的完整天然存在的基因组。一般来说，该多核苷酸是基本上分离的形式。即，基本上没有正常情况下在体内与完整基因组相联系的生物学材料。一般来说，术语“多肽”指表现出的生物学活性基本上相似于高半胱氨酸脱硫酶的生物学活性的氨基酸链或序列但不指具体长度的这种产物。如果需要，该多肽可在体内和/或体外进行修饰，例如，经过糖基化，酰胺化，羧基化，磷酸化和/或翻译后裂解修饰，因此其包含特别是肽，寡聚肽，蛋白质和融合蛋白质。自然，专业技术人员会预料到修饰的多肽应保留生理学功能，即，具有高半胱氨酸脱硫酶活性。编码高半胱氨酸脱硫酶的DNA片断可经过利用部分高半胱氨酸脱硫酶的cDNA来获得。经过信使RNA的逆转录且随后一般使用本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)技术进行扩增可获得该cDNA，例如，该PCR使用针对相关酶的保守区域设计的引物，如胱硫醚γ-裂解酶编码序列，例如，人，大鼠和/或酵母胱硫醚γ-裂解酶。然后使用含有部分高半胱氨酸脱硫酶基因的扩增片断从含有该基因的cDNA文库克隆完整的高半胱氨酸脱硫酶基因。该cDNA文库可来自原生动物，例如，阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)cDNA文库。以这种方式获得的含有高半胱氨酸脱硫酶基因的多核苷酸片断在附图说明图1和2中描述。图1的DNA片断编码含有下文称为CTLα(随后重新命名为MGL1)的396个氨基酸的开放阅读框(ORF)的基因ctlα(随后重新命名为mgl1)。图2的DNA片断编码含有下文称为CTLβ(随后重新命名为MGL2)的398个氨基酸的ORF的基因ctlβ(随后重新命名为mgl2)。图1和2所示的MGL1和MGL2与来自Pseudomonas putida的甲硫氨酸γ-裂解酶和来自酵母和人的胱硫醚γ-裂解酶(EMBL数据库登记号分别为D30039,P31373和S52784)相同性百分数(在氨基酸水平上)的比较在表1中显示。使用GCG Wisconsin程序包(Devereux,H.,Hacberli,P.Smithies,O.(1984)核酸研究，12,387-395)用缺口和加帽程序进行序列比较分析。表1 表1显示了图1和2所示的推断的高半胱氨酸脱硫酶与以前测序的甲硫氨酸γ-裂解酶和胱硫醚γ-裂解酶在氨基酸水平上仅有42-45％相同。因此，尽管使用针对胱硫醚γ-裂解酶保守区域设计的引物已克隆了MGL1和MGL2，但它们在多肽长度上基本上不相似。本专利技术还包括与图1和2中举例的片断具有至少80％，特别是至少90％，和特别是至少95％相似性的多核苷酸片断。本专利技术还包括与图1和2中举例的多肽具有至少80％，特别是至少90％，和特别是至少95％相似性的多肽序列。“相似性”指核苷酸或氨基酸相同和保守取代，前提是高半胱氨酸脱硫酶的酶功能基本上未受损失。技术人员会预料到可对基因或其衍生物进行遗传操作，例如，经过本领域普遍已知的重组DNA技术克隆基因并在体外或体内表达由此编码的多肽。具有图1和2所述核苷酸序列的多核苷酸片断或其衍生物优选用于高半胱氨酸脱硫酶的表达。应明白对于本文包含的具体高半胱氨酸脱硫酶多肽，可存在变异(天然或其它)。这些变异可表现为在全序列上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷厄姆·赫伯特·库伯斯，杰里米·查尔斯·莫特拉姆，大卫·约翰·普里特查德，罗伯特·斯图尔特·坎贝尔，
申请(专利权)人：格拉斯哥大学校董事会，
类型：发明
国别省市：