D-半胱氨酸酶法转化制备方法技术

本发明专利技术属于医药生物技术领域的Ｄ－半胱氨酸酶法转化制备方法。该制备方法采用ＤＬ－半胱氨酸作为原料，将具有高活力Ｌ－色氨酸酶的基因工程菌与含有ＤＬ－半胱氨酸的混合氨基酸或ＤＬ－半胱氨酸盐酸盐的转化液混合，３０～４５℃下进行酶促反应，然后用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度Ｄ－半胱氨酸和Ｌ－色氨酸。该方法实现了Ｄ－半胱氨酸和Ｌ－色氨酸的同时生产，具有原料价格低廉，操作简便，转化时间短，生产成本低优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物
，具体涉及。二
技术介绍
L-半胱氨酸是自然界存在的氨基酸，也是人体的非必需氨基酸之一，其盐酸 盐可以作为医药中间体、化妆品添加剂、食品添加剂、饲料添加剂等等，具有非 常广泛的应用。近年来其光学异构体D-半胱氨酸盐酸盐在医药方面的应用也越来越得到人 们的重视，它是手性药物第三代头孢抗生素药物头孢米诺钠的重要中间体。头孢 米诺钠在短时间内就能显示很强的杀菌力，适用于链球菌属(肠球菌除外)、大 肠埃希菌(J.Biol.Chem. 2001， 276(44)， 40864-40872)、肺炎克雷伯杆菌、变形 杆菌属、流感嗜血杆菌、类杆菌属引起呼吸系统感染、泌尿生殖系统感染、腹 腔感染、盆腔感染以及败血症等。2001年，王明章(CN雨310， 2001; CN1404817, 2001)等将DL-半胱氨 酸及其盐用于染发、烫发剂。其优点是无刺激性、无致过敏性、无致突变性、无 异臭味、不损伤发质等。用DL-半胱氨酸、DL-半胱氨酸及其盐作染发剂，染发 牢度好，自然光亮；用它作烫发剂(冷烫液)，头发巻曲度好，发巻波浪持久， 发质光亮自然，发型持久。2005年，王明彰等(CN1679502， 2005)将DL-半胱 氨酸或其盐应用于化妆品生产中。添加DL-半胱氨酸的化妆品能明显起到润肤、 美白、祛斑、消炎、抗痊疮、抗皱、抗衰老、防脱发、生发、去头屑的作用，而 且安全无副作用、见效快、制备方便。根据目前文献报导，D-半胱氨酸的制备方法主要有以下四种 1、生物酶法DL-S-节基-半胱氨酸盐酸盐水溶液中，加入一种从猪肝中提取的酶，37°C， 4h， L-S-节基-半胱氨酸被水解，而D-S-苄基-半胱氨酸依然留在溶液中。分离提 取，然后脱苄基得到D-半胱氨酸UP10001468， 1996)。此方法周期长，大约一 个星期；反应底物浓度低，约0.1mol/L;提纯困难，操作复杂，经常以消耗掉一 种对映体为代价。2、 优先结晶法1986年，Chozo等(US 4613688， 1986)将DL-半胱氨酸盐酸盐一水合物溶于35t:的水中，制成过饱和溶液，冷却到3rc，加入D-半胱氨酸盐酸盐一水合物，继续冷却到27.5'C，搅拌70min，过滤得到D-半胱氨酸盐酸盐一水合物。1987年，Tadashi等(Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1987， 60 (9)，3277-3283)将DL-半胱氨酸盐酸盐一水合物用浓氨水中和得到DL-半胱氨酸，然后与甲醛反应生成DL-四氢噻唑-4-甲酸(DL-TCA)，在40。C下形成150%过饱和溶液，加入晶种结晶，得到D-TCA，水解得到D-半胱氨酸，收率是2%。优先结晶法制备D-半胱氨酸，收率低，难于操作，不适合工业化生产。3、 化学拆分法1986年，Nohira等(US 4621151， 1986)用氢氧化钠中和DL-半胱氨酸盐酸盐为DL-半胱氨酸，然后与D-扁桃酸晶体形成非对映体化合物，加入D-半胱氨酸D-扁桃酸作为晶种，冷却结晶、过滤后重结晶，用异丙醚萃取D-扁桃酸，过滤固体得到D-半胱氨酸，收率18%，光学纯度80%。Tomuro等(US 4736060， 1988)将DL-半胱氨酸和甲醛反应得到DL-四氢噻唑-4-甲酸(DL-TCA),在其水溶液中加入光学活性的R-l-(l-萘基)-乙胺形成D-TCA和L-TCA的非对映体盐，根据二者在溶剂中的溶解度不同，分别获得D-TCA和L-TCA，并水解最终得到D-半胱氨酸和L-半胱氨酸。2006年，马云峰等(CN1876628， 2006)以DL-半胱氨酸为原料，以无机酸为溶剂，分别采用右旋二苯甲酰酒石酸(D-DBTA)和左旋二苯甲酰酒石酸(L-DBTA)为拆分剂，将DL-半胱氨酸拆分得到D-半胱氨酸和L-半胱氨酸。张涛等(精细与专用化学品，2006， 14 (6): 26-28)改进了 D-扁桃酸拆分DL-半胱氨酸制备D-半胱氨酸的方法，拆分收率达到25.6%。4、 不对称转化法不对称转化法是把L型氨基酸或DL型氨基酸直接转化为D型氨基酸的技术。2007年，喻明军等(应用化工，2007， 36 (5): 488-490)在水杨醛存在下，使L-半胱氨酸、L-酒石酸和丙酮在乙酸中加热，形成D-2， 2-二甲基四氢噻唑-4-羧酸-L-酒石酸盐， 光学纯度99%以上，收率65.6%。将该盐在水溶液中水解得到D-半胱氨酸，收率(以L-半胱氨酸计)>50%，光学纯度>99%。
技术实现思路
D-半胱氨酸酶法转化制备过程中，反应条件温和，L-色氨酸酶专一性很强， 转化率高，提取工艺简单，且产生附加值高的L-色氨酸。本专利技术的目的在于避 免上述现有技术中的不足之处而提供一种高效、低成本的D-半胱氨酸及L-色氨 酸的制备方法。本专利技术可以通过以下技术方案来达到，其步骤为(1) 色氨酸酶基因工程菌菌株WW-4 (韦平和等，以L-半胱氨酸和吲哚酶 法合成L-色氨酸，药物生物技术，2000， 4.)，在含有异丙基硫代半乳糖苷(IPTG， Sigma公司)或乳糖的培养基中培养，诱导产生高活力的色氨酸酶-，(2) 采用游离细胞法，将含酶细胞或酶提取液与缓冲液配制的含有DL-半胱 氨酸的混合氨基酸或DL-半胱氨酸的转化液混合后，再加入表面活性剂，在30 45 °C条件下进行酶促转化反应。(3) 将反应生成物进行分离，得到高纯度的D-半胱氨酸，同时还得到L-色 氨酸。上述步骤(1)中的培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和/或乳糖， 其浓度为1 20g/L，氮源采用有机氮源，如牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、 豆饼水解液和/或蛋白质水解物，其浓度为1 30g/L，加入IPTG或乳糖诱导， 其浓度为0.05 10g/L。上述步骤(2)的转化液缓冲体系为磷酸缓冲液、硼酸缓冲液和碳酸缓冲 液，使转化液pH7.5 9.5，最适转化液pH8 9;在转化液中加入表面活性剂， 如吐温-80，十六烷三甲基溴化铵(CTAB)，聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其浓 度为0.005 5 g/L。上述歩骤(3)中分离反应体系中D-半胱氨酸和L-色氨酸的方法是采用等电 点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂分离相结合的方法。本专利技术与现有技术相比具有如下优点 (1)本专利技术采用色氨酸酶基因工程菌WW-4在优选的培养基中培养可以高 产率的生成色氮酸酶，使反应有非常高的转化率和反应速率，D-半胱氨酸及L-色氨酸的光学纯度达到99%以上。(2) 本专利技术采用游离细胞法转化DL-半胱氨酸，同时制备得到D-半胱氨酸及L-色氨酸，原料价格低廉，操作简便，大大提高反应速率，简化工艺流程。(3) D-半胱氨酸和L-色氨酸的理化性质差异很大，利用溶解度的差异就可以分离制备，成本低，工艺流程简单，适合工业化生产。(4) 具有原料来源丰富，价格低廉，转化时间短，操作简便，生产成本低等优点。四具体实施方式实施例一1. 将1000mL发酵液离心得到的色氨酸酶基因工程菌22 g加入到0.1mol/L碳酸钠缓冲液(pH9.5)配制的600mL转化液中，转化液为含15% DL-半胱氨酸盐酸盐(g/mL)、 33.5g吲哚和0.05。/。O本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ｄ－半胱氨酸酶法转化制备方法，其特征是由以下步骤构成：　（１）具有高活力Ｌ－色氨酸酶的基因工程菌，在含有ＩＰＴＧ或乳糖的培养基中培养，产生高活力的Ｌ－色氨酸酶；　（２）用游离细胞法，将含酶细胞或酶提取液与缓冲液配制的含有ＤＬ －半胱氨酸的混合氨基酸或ＤＬ－半胱氨酸盐酸盐的转化液混合，再加入适量的吲哚、表面活性剂和磷酸吡哆醛，在３０～４５℃条件下进行酶促反应，将反应生成物进行分离，得到高纯度的Ｄ－半胱氨酸，同时还得到Ｌ－色氨酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：焦庆才，赵根海，刘均忠，张飞，刘茜，董凯，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]