鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，包括以下步骤：(1)从鸡垂体中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板，PCR得到鸡生长激素的基因片段；(2)利用毕赤酵母构建重组表达载体pPIC9K-cGH；(3)重组表达载体pPIC9K-cGH电转化毕赤酵母GS115，筛选得到转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-cGH；(4)通过甲醇诱导表达，并纯化得到鸡生长激素重组蛋白，通过细胞活性试验鉴定其活性。本发明专利技术首次实现鸡生长激素(cGH)重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达，并建立了纯化体系，可得到纯度较高的具有活性的鸡生长激素重组蛋白。该方法操作简便、产量高、成本低廉，为进一步研究鸡生长激素的结构、功能以及生产应用提供了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域中重组蛋白的生产和纯化方法，特别涉及鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化方法。
技术介绍
鸡生长激素(chickengrowthhormone,cGH)不仅对鸡的正常生长发育起着必要的调节作用，而且对鸡的多种生产性状也有着显著的影响，如体重、饲料转化率、脂肪蓄积、蛋生产、抗病性等。此外，通过注射外源GH，可以在胚胎时期显著提高鸡胚重量，促进其长骨及软骨组织的发育，从而提高肉用品种鸡的上市体重。相对于人和哺乳动物的生长激素的研究，鸡生长激素的研究起步较晚，但是随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用，酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，表现出不可比拟的优势。其中毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统，目前还未见任何鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中表达的报道。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术提供一种鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化方法，通过该方法获得高纯度且具有活性的鸡生长激素重组蛋白。技术方案：为了达到上述专利技术目的，本专利技术提供的鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，包括以下步骤：(1)从鸡垂体中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板，PCR得到鸡生长激素的基因片段，其碱基序列如SEQIDNO：1所示；(2)将步骤(1)所得基因片段插入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K，并在C端添加6个His标签，得到重组表达载体pPIC9K-cGH；(3)重组表达载体pPIC9K-cGH电转化毕赤酵母GS115，并通过组氨酸缺陷筛选和G418筛选得到转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-cGH；(4)通过甲醇诱导表达，经镍柱、凝胶柱纯化得到鸡生长激素重组蛋白。所述鸡生长激素(chickengrowthhormone,cGH)的基因位于1号常染色体的长臂末端，全长约为4kb，由5个外显子及4个内含子构成。cGH由191个氨基酸组成，分子量约为22KDa，与鸭的生长激素具有很高的同源性，只有4个氨基酸的差异，与火鸡生长激素的同源性为96％。Genbank已公布的鸡生长激素mRNA序列(NM_204359)。所述鸡生长激素基因片段的碱基序列如SEQIDNO：1所示，其编码的重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。所述步骤(2)重组表达载体的构建中，为了便于后续纯化重组蛋白，将步骤(1)所得基因片段插入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K时，需要在C端添加6个His标签。其操作可以借助于含有His标签的pET-30a(+)载体，具体为：将步骤(1)所得基因片段插入含有His标签的pET-30a(+)载体，并以其为模板，PCR扩增得到含有His标签的鸡生长激素的基因片段并插入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K，得到重组表达载体pPIC9K-cGH。其中，可以先将步骤(1)所得基因插入pMD19-T载体，命名为pMD19-T-cGH，然后根据设计引物进行上述PCR扩增。所述步骤(3)具体可以为：将构建好的pPIC9K-cGH重组表达载体用SacI线性化，然后与毕赤酵母GS115感受态细胞混合，经电转之后培养长出转化子。将所有转化子用无菌去离子水洗下涂含有不同浓度G418的YPD平板，培养筛选高拷贝数的转化子。采取煮-冻-煮法提取转化子基因组，做PCR鉴定，鉴定正确的高拷贝转化子命名为GS115-pPIC9K-cGH。所述电转条件为1500V，6ms。所述步骤(4)具体可以为：将转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-cGH单菌落接种于培养基中培养活化；将活化后的菌液接种于BMGY培养基中，培养16-20h至OD600达到2-6，2500×g，5min离心收集菌体，换用BMMY培养基诱导表达，添加甲醇连续诱导，筛选出高表达菌株。所述诱导表达所用甲醇为培养基体积的1％。所述诱导表达时间为24-96h，最优表达时间为96h。步骤(4)中镍柱、凝胶柱纯化具体为：取100mL的GS115-pPIC9K-cGH诱导上清，用8000KDa透析袋在镍柱2L结合液中透析18h，每6h换一次液；将透析后的诱导上清用镍柱纯化，再采用凝胶层析方法去除其中杂蛋白，即得纯度达到95％以上的鸡生长激素重组蛋白。最后通过细胞活性试验鉴定所得重组蛋白的活性。有益效果：本专利技术首次实现鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达并纯化，从而得到高纯度的鸡生长激素重组蛋白；产生的目的蛋白可以直接分泌到培养液中，方便分离，而细胞可以被重新利用进行诱导目的蛋白，可应用于连续发酵生产的模式，大大提高目的蛋白的产生，提高发酵效率，简化发酵过程和降低成本；同时避免了原核细胞所产生的一些内毒素物质和热源等一些不易去除的物质，目的蛋白纯度更高。即本专利技术方法操作简单、产量高、成本低。附图说明图1：pPIC9K-cGH重组载体酶切检验琼脂糖电泳分析图(M为DL2000DNAMaker；1为EcoRI、NotI双酶切的pPIC9K-cGH重组载体。经双酶切后产生一条600bp左右的cGH条带和一条大于2000bp的质粒条带，表明cGH序列已成功插入表达载体。)图2：GS115-pPIC9K-cGH基因组PCR检验琼脂糖电泳分析图(M为DL2000DNAMaker；1为阴性对照；2-6为以不同转化子基因组做模板PCR产物。提取转化子基因组做PCR能得到与cGH大小相符的条带说明pPIC9K-cGH成功转入GS115。)图3：GS115-pPIC9K-cGH不同诱导时相培养上清的SDS-PAGE电泳分析图(M为PremixedProteinMarker；1为诱导96h的上清；2为诱导72h的上清；3为诱导48h的上清；4为诱导24h的上清。)图4：GS115-pPIC9K-cGH诱导上清镍柱纯化SDS-PAGE电泳分析图(M为PremixedProteinMarker；1为诱导液上清；2为过柱液；3、4为50mM咪唑洗涤液；5、6为100mM咪唑洗涤液；7、8为500mM咪唑洗脱液。结果表明，洗涤液咪唑为50mM时可洗掉部分杂蛋白，当咪唑浓度提高100mM时目的蛋白开始被洗下，用500mM咪唑洗脱可得到大部分预测大小为25KDa左右的鸡生长激素重组蛋白，但是纯度不高。)图5：鸡生长激素重组蛋白凝胶层析纯化SDS-PAGE电本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)从鸡垂体中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板，PCR得到鸡生长激素的基因片段；(2)将步骤(1)所得基因片段插入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K，并在C端添加6个His标签，得到重组表达载体pPIC9K‑cGH；(3)重组表达载体pPIC9K‑cGH电转化毕赤酵母GS115，并通过组氨酸缺陷筛选和G418筛选得到转基因重组酵母菌株GS115‑pPIC9K‑cGH；(4)通过甲醇诱导表达，经镍柱和凝胶柱纯化得到鸡生长激素重组蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于，
该方法包括以下步骤：
(1)从鸡垂体中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为
模板，PCR得到鸡生长激素的基因片段；
(2)将步骤(1)所得基因片段插入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K，并在
C端添加6个His标签，得到重组表达载体pPIC9K-cGH；
(3)重组表达载体pPIC9K-cGH电转化毕赤酵母GS115，并通过组氨酸缺
陷筛选和G418筛选得到转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-cGH；
(4)通过甲醇诱导表达，经镍柱和凝胶柱纯化得到鸡生长激素重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化
方法，其特征在于步骤(2)如下：将步骤(1)所得基因片段插入含有His标签
的pET-30a(+)载体，并以其为模板，PCR扩增得到含有His标签的鸡生长激
...

【专利技术属性】
技术研发人员：郁建锋，顾志良，何赛，张艳萍，金泽楷，周欢庆，姚丽娟，
申请(专利权)人：常熟理工学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32