本发明专利技术“高效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法”，属于植物病虫防治领域。以转入有RNA干扰载体pCAGC1341-TGPM01RNAi的转基因番茄为宿主植物转化外植体，转入表达Bt-Cry6A晶体蛋白的载体，获得双重抗根结线虫的转基因番茄品种。本发明专利技术还提供了转基因的优化方法。本发明专利技术合成的基因是对密码子进行优化的。将优化后的编码Bt-Cry6A晶体蛋白的人工基因以及转有该基因的番茄品种，显示比转化单一基因的抗线虫效果好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病虫防治
，高效RNA干渉基因和杀线虫Bt基因聚合转化番茄，双重效果共同防治根结线虫。
技术介绍
根结线虫病严重危害我国蔬菜、棉花、花生、烟草等多种经济作物和水稻、玉米等粮食作物的重要生物灾害，近年来农业种植结构与布局调整后问题进一歩突出。目前对于作物线虫病害的防治主要依赖于杀线虫剂，由于杀线虫剂防治效果差导致农业减产，加之不合理使用带来了产品污染和生态环境破坏。因此，作物线虫病害的严重危害，直接威胁着我国的粮食安全和农产品安全。利用植物介导的RNAi沉默线虫的关键基因成为潜在的最有价值的防治策略，可实现对植物线虫RNAi介导的分子调控(Urwin et al., 2002; Atkinson etal.，2003; Victoria et al.，2008)。根结线虫和胞囊线虫的生长和繁殖所需的营养物质是通过寄生在植物根部提供，利用植物表达线虫特异基因的dsRNA可实现对植物线虫的RNAi介导的分子调控。从微生物资源中挖掘抗线虫基因是另ー个重要的途径。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的内毒素是ー种对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、线虫等无脊椎动物具有活性的杀虫晶体蛋白(Crystal protein)，对人、畜和ー些有益昆虫不产生毒害作用，且不会造成环境污染。目前全世界共获得了 70种转Bt基因的植物，种植面积达到26亿公顷(James，2005)。虽然在80年代初就有公司对Bt对线虫具有毒杀作用进行了专利保护。但是，人们对Bt杀线虫基因的研究却较少。2000年,加州大学Marroquin等(Marroquin et al.，2000)证实Bt杀虫晶体蛋白对线虫具有毒杀作用，具有杀线剂的潜力。将晶体蛋白喂食模式线虫发现线虫出现不育，死亡等症状。2003年，加州大学的Wei等(Weiet al., 2003)研究表明，Cry5Aa> Cry5B> Cry6B> Cryl2A> Cryl3A> and Cryl4A> Cry21A 蛋白对模式线虫均有毒杀作用。随后，Barrows等(Barrows et al.，2007)验证了 Cry5B对模式线虫的作用。但是Bt杀虫晶体蛋白对植物寄生线虫的研究却没有进展。直到2007年和2008年，美国加州大学才将对模式线虫具有杀虫效果的Cry6A和Cry5B基因分别转化到番茄(Li et al., 2007; Li et al.，2008)，接种南方根结线虫后发现，与对照相比，转基因番茄的根结数量和卵块数量均明显下降，说明Bt杀线虫基因具有巨大的应用潜力。目前，已发现cry5、cry6、cryl2、cryl3、cryl4和cry21基因对线虫具有毒杀作用。苏云金芽胞杆菌的晶体毒蛋白具有广谱的毒杀线虫功能，其基因在转基因抗线虫育种中将具有广泛的利用前景，但仍需提高特异毒杀寄生线虫的活性。如通过转基因叠加多个抗线虫功能基因来转化培育作物广谱高效的抗线虫新品种。利用转基因技术 创造新的抗线虫植物品系对植物寄生线虫的防治，环境保护及农业可持续发展具有重要意义。但是，単一基因的转化，其防效有限。因此，采用转化作用不同的分子靶标基因有助于提高植物的抗性。由于RNA干渉和Bt对植物线虫的作用分子靶标不同，将这两种基因以不同的进行叠加转化与功能聚合，将可达到高效、广谱和持久抗线虫的效果。
技术实现思路
本专利技术根据上述领域存在的空白和根结线虫防治的需要，提供一种高效RNA干渉基因和杀线虫Bt基因共同作用的抗线虫方法及品种资源，本专利技术的技术方案如下:一种，其特征在于，包括如下步骤:(1)以转入有尺熟干扰载体？046(:1341づ6 11018熟1的转基因番茄为宿主植物转化外植体，(2)构建含有外源基因的表达载体，所述外源基因指编码苏云金芽孢杆菌的Bt-Cry6A晶体蛋白的基因，(3)将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子。所述构建好的重组表达载体指pBI121-06。所述将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子，其特征在于采用农杆菌介导的转化，所述农杆菌为根瘤农杆菌EHA105。所述将重组表达载体 转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子，包括如下步骤:( I)准备宿主植物转化外植体，(2)制备根瘤农杆菌转化液，(3)根癌农杆菌转化液侵染外植体,然后共培养，(4)对共培养的外植体进行选择培养以分化愈伤组织，，(5)生根培养分化的愈伤组织获得转基因植株。所述准备植物转化外植体包括外植体预培养，指将取自番茄幼苗的外植体放置在MS+50 u g/ u Iこ酰丁香酮的固体培养基上，光照预培养2天，所述共培养指采用MS+100ii g/ii Iこ酰丁香酮固体培养基，避光培养2天。所述选择培养指采用MS+2mg/L 6BA+0.2mg/L IAA+300mg/L羧苄青霉素+50 y g/ml卡那霉素+IOy g/ml玉米素,26_28°C,光照培养16h,所述生根培养指长到2 3厘米的分化良好的愈伤组织转移到生根培养基MS+0.25mg/LIAA+25 u g/ml 卡那霉素 +200 u g/ml 头孢霉素上。所述制备根瘤农杆菌转化液指采用1/2浓度的液体MS + 200 U g/ U I的こ酰丁香酮为悬浮剂悬浮菌体。本专利技术前期，将南方根结线虫的蛋白激酶基因MiMPKl基因的编码区域的片段构建成RNA干扰载体转入番茄中，获得转MiMPKl基因RNA干扰载体的番茄植株，对转基因番茄植株接种南方根结线虫，结果表明，转基因植株的根结和卵块数量降低。本专利技术提供优化的Bt_Cry6A核苷酸序列，为使Bt_Cry6A基因其更适合于在植物中表达，本专利技术对表达Bt_Cry6A晶体蛋白Seq ID No2的初始核苷酸序列Seq ID No3的密码子进行优化并合成。合成后的核苷酸序列Seq ID N0.4。本专利技术将合成的Bt_Cry6A基因克隆至载体pB1121获得表达载体pB1121-06，转入PBI121-06，获得转双基因的番茄植株——同时表达MiMPKl基因和Bt-Cry6A基因的Ttl代植株，将南方根结线虫的2龄幼虫接种到该植株的根部，45天后发现转双基因植株比对照植株的卵块数量低70%，以转化単一基因的阳性植株为对照，表达2个基因的植株对根结线虫的抗性明显更強。本专利技术的实验充分说明高效RNA干渉基因和杀线虫Bt基因共同作用的番茄品种是抗线虫的优质品种资源。在植物抗线虫的转基因工程中具有重要的应用价值。本专利技术提供了可靠的有效的线虫防治策略。附图说明图1.载体pCAGC1341构建流程图2.载体 pCAGC1341_TGPM01RNAi 构建流程图3.T0代转基因番茄植株靶标基因的PCR检测图4 载体pBI121-06结构示意5.转Bt_Cry6A基因的Ttl代番茄植株靶标基因的PCR检测图6.T0代转双基因番茄植株RT-PCR检测图7.转基因番茄的根部接种线虫45天后的根结和卵块情況。A:对照植株的根部；转干扰基因植株的根部；B ■ 转Bt基因植株的根部；D:转双基因植株的根部具体实施例方式以下通过试验及数据具体说明本专利技术的实施和其取得的有益效果。生物材料: 南方根结线虫(Melo本文档来自技高网...
【技术保护点】
高效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以转入有RNA干扰载体pCAGC1341?TGPM01RNAi的转基因番茄为宿主植物转化外植体，（2）构建含有外源基因的表达载体，所述外源基因指编码苏云金芽孢杆菌的Bt?Cry6A晶体蛋白的基因，（3）将表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子。
【技术特征摘要】
2011.11.18 CN 201110369832.71.效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)以转入有1 嫩干扰载体？046(:1341-16 11011 嫩1的转基因番茄为宿主植物转化外植体， (2)构建含有外源基因的表达载体，所述外源基因指编码苏云金芽孢杆菌的Bt-Cry6A晶体蛋白的基因， (3)将表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子。2.据权利要求1所述的方法，所述构建好的重组表达载体指PBI121-06。3.据权利要求2任一所述的方法，所述将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子，其特征在于采用农杆菌介导的转化，所述农杆菌为根瘤农杆菌EHA105。4.权利要求3所述的方法，所述将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子，包括如下步骤: (1)准备宿主植物转化外植体， (2)制备根瘤农杆菌转化液， ...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈国华，王殿东，田雪亮，王运生，茆振川，杨宇红，谢丙炎，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
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