一种动物饲料抗菌肽的生产工艺及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种动物饲料抗菌肽的生产工艺及其应用，尤其是抗菌肽家族中Gallinacin系列中的GAL-6的生产工艺及其应用。该工艺利用基因重组技术，将动物源性的GAL-6基因克隆到质粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6为模板，用PCR方法获得GAL-6基因，构建表达质粒pPIC9K-GAL-6，并转化毕赤酵母；经多级放大培养至中试生产后，全面优化发酵培养条件，放大到生产化发酵培养，经纯化后得到高纯度、活性好的成品GAL-6蛋白制剂。该蛋白制剂的应用采用动物饮水或颗粒饲料制粒后喷涂的方法以克服高温、高压等对蛋白制品的破坏性。与现有技术相比，本发明专利技术具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物饲料添加剂，尤其涉及一种动物饲料抗菌肽的生产工艺及其应用。
技术介绍
2005年7月，四川省资阳、内江等地爆发猪链球菌病疫情致人死亡，这再次迫使人们追问:动物滥用抗生素的威胁链到底有多长？由于抗生素饲料添加剂可以提高动物生产效率，在食用动物饲养中被广泛使用。1996年，全世界抗生素饲料添加剂的用量已经占全部饲料添加剂用量的45.8%，抗生素生产总产量的50%左右用于畜牧业。但是，由于持续低水平饲喂抗生素，抗生素饲料添加剂造成的细菌耐药性、畜产品药物残留、过敏中毒反应以及“三致”作用等危害日益严重，越来越受到人们的关注和许多国家的限制。1986年，瑞典成为第一个不准使用抗生素作为饲料添加剂的国家，全面禁止在畜禽饲料中使用抗生素。1997年 ，联合国粮农组织(FAO)要求停止或禁止使用抗生素饲料添加剂。1998年12月又提议在10年内淘汰抗生素饲料添加剂。从2000年I月起，丹麦的抗生素只限于按处方用于治疗动物疾病。欧盟委员会决定从2006年I月I日起，在欧盟成员国全面停止使用所有抗生素生长促进剂，包括离子载体类抗生素。2004年，世界卫生组织(WHO)、FA0和世界本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种动物饲料抗菌肽的生产工艺，其特征在于：利用基因重组技术，将动物源性的GAL?6基因克隆到质粒pGEM?3Zf，并以pGEM?3Zf?GAL?6为模板，用PCR方法获得GAL?6基因，构建表达质粒pPIC9K?GAL?6并转化毕赤酵母；经多级放大培养至中试生产后，全面优化发酵培养条件，放大到生产化发酵培养，经提取纯化得到高纯度、高活性成品GAL?6蛋白制剂。

【技术特征摘要】
1.一种动物饲料抗菌肽的生产工艺，其特征在于:利用基因重组技术，将动物源性的GAL-6基因克隆到质粒pGEM-3Zf，并以pGEM_3Zf-GAL_6为模板，用PCR方法获得GAL-6基因，构建表达质粒PPIC9K-GAL-6并转化毕赤酵母；经多级放大培养至中试生产后，全面优化发酵培养条件，放大到生产化发酵培养，经提取纯化得到高纯度、高活性成品GAL-6蛋白制剂。2.根据权利要求1所述的一种动物饲料抗菌肽的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤:1).毕赤酵母PPIC9K-GAL-6表达质粒的构建:将动物源性的GAL-6基因克隆到质粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6为模板，用上、下游引物扩增GAL-6基因；反应条件是:94°C变性3分钟；然后94°C变性40s，40°C退火40s，72°C延伸60s，进行5 30个循环；然后94°C变性40s，55°C退火40s，72°C延伸60s，进行20 40个循环；最后72°C延伸5分钟，4°C保温；PCR产物通过EcoRI和NotI酶切位点与质粒PPIC9K连接重组，转化感受态大肠杆菌；挑阳性克隆抽提质粒后进行EcoRI和NotI双酶切鉴定，经PCR扩增得到基因DNA片段长502bp，电泳分析结果显示在400bp 600bp处有特异性条带，与预测片段长度一致，重组质粒酶切鉴定片段长度与理论预测一致，核苷酸序列分析结果完全正确，并测定DNA序列；重组质粒命名为PPIC9K-GAL-6 ；2).电转化毕赤酵母及筛选多拷贝阳性克隆:参照 Invitrogen 公司 Mult1-Copy Pichia Expression Kit 说明书操作；用 Sal I 酶切重组质粒PPIC9K-GAL-6·，使其完全线性化，经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后电转化感受态毕赤酵母GS ;电击参数为:电压1500V，电容25yF，电阻200Ω ;涂布MD平板，30°C静置培养48h ;挑单克隆菌落接种至96孔细胞培养板，经同步化后分别接种至含O、1.0,2.0,4.0g/LG418的YPD平板上，30°C静置培养至长出单克隆菌落；3).PCR法鉴定:在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆至20 μ L0.25 % SDS溶液中，混匀后90 V加热3min，离心后取I μ L上清作模板，用上游引物和下游引物进行PCR反应；反应体系50 μ L，含 1% Triton X-100 ;反应条件:95°C 变性 5min ;95 °C变性 60s，55 °C退火 60s，72 °C 延伸60s，进行20 50个循环；最后72°C延伸3min，4°C保温；根据PCR结果酶切后电泳鉴定重组质粒；4).实验室培养:在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆于YPD培养液中，30°C，250r/min振荡培养12h，得到一级种子液；将一级种子液接种至1200mL BMGY培养液中，振荡培养16h，至0D600 =10 12，得到二级种子液；将二级种子液接种至20LBMMY培养液中，用28%氨水调节pH至5.0 ;发酵培养条件为:温度30°C，搅拌速度200r/min，溶氧度35%，自动补加氨水维持PH5.1 ;继续培养18h至0D600 = 100 120，待溶氧度快速上升，培养液中甘油耗尽时开始补加50%甘油溶液，速度80mL/h，时间2 3h，至0D600 = 150 160时停止补加甘油，待其完全耗尽时立即开始补加甲醇进行诱导表达，速度30mL/h，时间30h ;诱导表达结束后，发酵液放入冷却罐，按放罐发酵液质量3%的量加入固体NaCl，搅拌至盐溶解，待温...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟诚，
申请(专利权)人：上海高龙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：