一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法技术

一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，将第一目标重组质粒电转化第一重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第一目标菌，所述第一目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白；或将第二目标重组质粒电转化第二重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第二目标菌，所述第二目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii,在下文中简称Li)基因组的方法。
技术介绍
Li属于李斯特菌属，仅对绵羊等动物致病，不对人致病，具有与李斯特菌属内另一种菌-单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,在下文中简称Lm)相似的生物学特性。Lm由于具有独特的能在感染的宿主吞噬细胞浆内生长的生物学特性，成为了良好的T细胞免疫活化佐剂，已在疫苗制备上得到了广泛应用，部分以Lm为载体的重组活菌治疗性肿瘤疫苗已进入临床试验阶段。如Wood LM et al.报道构建的两种基因重组Lm活菌疫苗(Lm-LLO-⑶105A和Lm-LLO-⑶105B)能显著减小乳腺癌小鼠动物模型的原发性和转移性肿瘤组织体积、降低乳腺癌自发小鼠模型肿瘤发生率(Wood LM, Pan ZK, Guirnalda P，et al.Targeting tumor vasculature with novel Listeria-based vaccines directedagainst CD105.Cancer Tmmunol Immunother.201本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将从含有拟整合外源基因的生物基因组模板或基因克隆质粒库内PCR扩增得到的上游带Hind?Ⅲ酶切位点、下游带Xho?I酶切位点的外源拟整合基因，插入第一重组质粒的Hind?III酶切位点与Xho?I酶切位点之间，得到中间重组质粒，所述第一重组质粒的基因序列为序列表中SEQ?ID?NO.1所示；（2）切下步骤（1）得到的中间重组质粒的BamH?I酶切位点与Xho?I酶切位点之间的片段插入第二重组质粒的BamH?I酶切位点与Xho?I酶切位点之间，得到第一目标重组质粒，所述第二重组质粒的基因序列为序列表中SEQ?ID?NO....

【技术特征摘要】
1.一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于包括以下步骤: (I)将从含有拟整合外源基因的生物基因组模板或基因克隆质粒库内PCR扩增得到的上游带Hind III酶切位点、下游带Xho I酶切位点的外源拟整合基因，插入第一重组质粒的Hind III酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到中间重组质粒，所述第一重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID N0.1所示； (2 )切下步骤(I)得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第二重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第一目标重组质粒，所述第二重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID N0.2所示； 或切下步骤(I)得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第三重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第二目标重组质粒，所述第三重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID N0.3所示； (3)将步骤(2)得到的第一 目标重组质粒电转化第一重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第一目标菌，所述第一重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，在其基因组orfBAldh基因上游整合入了 β-半乳糖苷酶基因，能表达半乳糖苷酶，在含5-溴_4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第一目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白； 或将步骤(2)得到的第二目标重组质粒电转化第二重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第二目标菌，所述第二重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组orfBAldh基因上游整合入了 β -半乳糖苷酶基因，能表达β -半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第二目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白。2.根据权利要求1所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第一重组质粒的步骤如下: (1)扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒包膜蛋白GP5编码基因0RF5的基因片段，其上游带Hind III酶切位点，下游带Xho I酶切位点； (2)将步骤(I)所述0RF5基因片段插入质粒pHS-LV的HindIII酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第一重组质粒。3.根据权利要求1所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第二重组质粒的步骤如下: (1)扩增上游带HindIII酶切位点、下游带Not I酶切位点的绵羊李斯特菌orfXYZ基因，并将所述orfXYZ基因插入质粒pHS-LV的Hind III酶切位点与Not I酶切位点之间； (2)扩增上游带SalI酶切位点、下游带SpeI酶切位点的Ery基因，并将所述Ery基因插入步骤(I)所得重组质粒的Sal I酶切位点与Spe I酶切位点之间； (3)扩增上游带XbaI酶切位点、下游带Not I酶切位点的绵羊李斯特菌orfBAldh基因，并将所述orfBAldh基因插入步骤(2)所得重组质粒的Xba I酶切...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪川，沈海浅，
申请(专利权)人：上海颂悦实业有限公司，汪川，
类型：发明
国别省市：