睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶基因增强菌株构建及应用制造技术

一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶基因增强菌株构建，属于微生物领域。其特征是：重组质粒为pK-Tacpromoter-3，17β-HSD；a.以睾丸酮丛毛单胞菌基因组为模板，通过PCR技术扩增，回收、纯化目的片段后，与pUCm-T载体连接；b.以质粒pAH10为模板，通过PCR技术扩增基因片段，回收、纯化目的片段后，与pUCm-T载体连接；c.采用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取重组质粒3，17β-HSD-T；d.采用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒分别提取重组质粒与pK-3，17β-HSD。有益效果是：首次构建睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-HSD基因增强菌株，并对它进行了应用，对于雌三醇、胆固醇、睾丸酮的降解效率较野生型睾丸酮丛毛单胞菌对于降解效率提高30%、15%和150%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于应用环境微生物领域。
技术介绍
睾丸酮丛毛单胞菌是革兰氏阴性菌，偏端丛生鞭毛，运动，在自然界中分布广泛。该菌是好气不发酵，化能有机营养型的细菌，能够以睾丸酮、胆固醇、雌三醇等留体激素作为唯一的碳源及能源。3,17 β-HSD是睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni)中降解类固醇等物质的系列酶中的关键酶，然而对于其基因结构及功能未进行研究，国内未见报道。尤其是在C.testosteroni以及假单胞杆菌中未见报道。Tac promoter为在大肠杆菌中具有功能的trp-lac杂合启动子,其-20区上游转录起始点的DNA序列来源于trp启动子，-20区下游的DNA序列来源于lac UV5启动子。Tac promoter比去阻遏的母本lac UV5启动子有效地提高转录速率大约11倍；比在没有trp抑制子存在的trp启动子转录速率大约提高3倍。
技术实现思路
本专利技术的目的是:提供一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17 β -羟基类固醇脱氢酶基因增强菌株构建及应用，它利用基因同源重组技术，在睾丸酮丛毛单胞菌基因组中同源插入Tacpromoter与3，17 β -羟基类固醇脱氢酶(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β?羟基类固醇脱氢酶基因增强菌株构建，其特征是：重组质粒为pK?Tac?promoter?3，17β?HSD；a.以睾丸酮丛毛单胞菌基因组为模板，通过PCR技术扩增3，17β?HSD基因片段，回收、纯化目的片段后，与pUCm?T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，采用氨苄青霉素抗性平板筛选获得阳性克隆菌株，测序，比对分析确保获得与模版序列完全匹配的3，17β?HSD基因重组质粒3，17β?HSD?T；b.?以质粒pAH10为模板，通过PCR技术扩增Tac?promoter基因片段，回收、纯化目的片段后，与pUCm?T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，采用氨苄青霉素抗性平板...

【技术特征摘要】
1.一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17 β -羟基类固醇脱氢酶基因增强菌株构建，其特征是:重组质粒为 pK-Tac promoter-3,17 β -HSD ； a.以睾丸酮丛毛单胞菌基因组为模板，通过PCR技术扩增3，17β -HSD基因片段，回收、纯化目的片段后，与PUCm-T载体连接，转化大肠杆菌DH5 α，采用氨苄青霉素抗性平板筛选获得阳性克隆菌株，测序，比对分析确保获得与模版序列完全匹配的3，17 β -HSD基因重组质粒 3，17 β -HSD-T ； b.以质粒pAHIO为模板,通过PCR技术扩增Tacpromoter基因片段，回收、纯化目的片段后，与PUCm-T载体连接，转化大肠杆菌DH5 α，采用氨苄青霉素抗性平板筛选获得阳性克隆菌株，测序，比对分析确保获得与模版序列完全匹配的Tac piOmoter基因重组质粒Tacpromoter—T ； c.采用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取重组质粒3，17β -HSD-T,采用EcoR I与XbaI分别对ΡΚ18质粒与3，17 β -HSD-T质粒进行双酶切，然后分别回收目的...

【专利技术属性】
技术研发人员：于源华，王保学，于化东，李艳红，王妍，
申请(专利权)人：长春理工大学，
类型：发明
国别省市：