一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌制备方法技术

本发明专利技术公开了一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌制备方法，包括以下步骤：1).总RNA的提取；２).S基因的克隆；３).表达载体的构建。乳酸乳球菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，本身具有抑菌抗菌、抗腹泻等特点，可以广泛开展活菌口服疫苗研究。本发明专利技术构建成的重组乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-S能稳定可靠的表达具有活性的TGEV的S蛋白；该重组菌可用来生产基因工程亚单位疫苗和基因工程活载体疫苗，用于TGE的预防提供一个新方法；生产成本较低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌制备方法。
技术介绍
猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由冠状病毒科猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的以仔猪呕吐、严重腹泻和高致死率为特征的消化道传染病。该病是我国及世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病之一。疫苗免疫接种是预防本病的主要措施。实践证明，肠道粘膜免疫所产生的分泌型抗体(sIgA)是抵抗TGEV感染的有效抗体，而非经口免疫所产生的其它血清抗体，如IgG、IgM对本病的免疫保护效果并不理想。因此选择安全无毒，能够在肠道中存活并能表达和传递抗原物质的载体系统，有效的刺激粘膜免疫系统所产生的粘膜免疫应答对本病的防治具有重要意义。然而，现有的疫苗一般需要注射，常规注射疫苗会产生应激及疫苗吸收的问题，而通过口服免疫时，免疫原在到达小肠粘膜之前会存在被降解或灭活的可能，虽然以细菌病毒为活载体可达到这一目的，但细菌病毒对人体会有一定的伤害性，且不能在肠道粘膜定居。专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1).？总RNA的提取取已处理的TGEV细胞毒悬液250μl分别加入到无菌无RNA酶的离心管，再加入750μl？TRIzol？LS？Reagent，颠倒混匀后于4℃静置5分钟；加入200μl预冷的氯仿，4℃保存；振荡至充分乳化均匀，4℃静置15分钟；于4℃、12000r/min离心15分钟，取出离心管，轻轻吸取上层水相约450μl移入另一离心管；加入等体积冷异丙醇，？20℃保存，颠倒混匀后置？20℃？30分钟；4℃、12000r/min离心10分钟，取出离心管，弃去上清液，加入1毫升？75％的冷乙醇，？20℃保存，颠倒数次...

【技术特征摘要】
1.一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1). 总RNA的提取
取已处理的TGEV细胞毒悬液250μl分别加入到无菌无RNA酶的离心管，再加入750μl TRIzol LS Reagent，颠倒混匀后于4℃静置5分钟；加入200μl预冷的氯仿，4℃保存；振荡至充分乳化均匀，4℃静置15分钟；于4℃、12000r/min离心15分钟，取出离心管，轻轻吸取上层水相约450μl移入另一离心管；加入等体积冷异丙醇，-20℃保存，颠倒混匀后置-20℃ 30分钟；4℃、12000r/min离心10分钟，取出离心管，弃去上清液，加入1毫升 75％的冷乙醇，-20℃保存，颠倒数次洗涤核酸；于4℃、12000r/min离心5分钟，取出离心管，弃去上清液，倒置EP管干燥核酸，然后用DEPC水20μl溶解，离心管中的溶液就是TGEV的总RNA；
２).S基因的克隆
根据TGEV S基因5和3，末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，每个引物的5，端包含一个方便将基因克隆到载体上的限制酶切位点；
序列1：5’-cgttgtcgacccatgaaaaaactgttcgttgttctggttgtaat-3’
序列2：5’-agaagcttttaatcgtgcacaccactattatcagacggtacaccc-3’
这对引物序列1和序列2被用来进行RT-PCR扩增产生cDNA；取总RNA液8μl，加入1μl 40μ mol/L反向引物序列2，70~80℃变性5分钟，立即冰浴3分钟；随后依次加入4μl M-MLV 5×RT buffer，5μl 4mmol/L dNTPs，40u Rnasin，200u M-MLV，混合，离心，加入DEPC水使总体系达20μl，离心数秒种后，37℃水浴1小时，95℃10分钟灭活RT酶；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李朝阳，李明义，石乔，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：