本发明专利技术提供了一种纤维素降解梭菌(Clostridium?cellulolyticum)的高效基因敲除方法。本发明专利技术涉及菌株遗传改造领域，具体涉及降解纤维素产乙醇梭菌的遗传改造领域。本发明专利技术首次在纤维素降解梭菌中实现定向基因敲除，且基因敲除的阳性率达95％以上。这为对纤维素降解梭菌进行进一步的遗传改造奠定了技术基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及菌株改造领域，具体涉及降解纤维素产乙醇梭菌遗传改造领域。
技术介绍
随着能源资源的日趋短缺以及环境污染问题日益突出，加快新能源的开发和利用，开辟新型能源供应，对于缓解国家能源供需矛盾，有效保护生态环境，实现可持续发展具有重要意义。地球上丰富的生物资源，为新型生物能源的开发和利用提供了前提和保障。与传统的发酵淀粉或糖类生产生物燃料相比，以纤维素为原料生产生物乙醇具有原料广泛、成本低、温室气体排放少等优点，因此纤维素生物能源的开发和利用将能够弥补化石能源的不足。整合生物技术(Consolidated bioprocessing CBP)在纤维素生物质能源转化中具有无可替代的优越性，它可以同步实现纤维素酶的生产、纤维素的水解和发酵。纤维素降 解梭菌(Clostridium cellulolyticum)是一种嗜中温革兰氏阳性厌氧菌,能够一步实现纤维素酶的生产、纤维素的水解和发酵，以及乙醇、乙酸、乳酸、CO2和H2等产物的生产的过程，因此是通过CBP生产纤维素乙醇的模式菌株。纤维素降解梭菌于上世纪八十年代首次从腐草中分离得到。自此，对该菌的研究主要集中在探索与纤维素降解相关基因功能，纤维小体结构与功能及相关酶的酶学性质等方面。直到2000年，实验人员才初步研究了该菌的遗传转化系统，为下一步遗传改造奠定了基础。根据已有的转化方法，研究人员实现了外源基因在纤维素降解梭菌中的表达，从而改造其代谢途径，提高目的产物的产量。如，通过遗传工程的方法在该菌中补充完整的异丁醇合成途径，使纤维降解梭菌能够发酵纤维素生产异丁醇。2009年，纤维素降解梭菌的基因组得到测序，使得对其在遗传水平上的有针对性的研究成为可能。然而，有关纤维素降解梭菌遗传改造方面的研究至今仍停留在表达自身或外源基因的水平上，而采用基因失活的方法对其进行遗传改造仍无人问津。通过分析可知，问题症结所在正是纤维素降解梭菌中进行基因失活方法的缺乏。本专利技术提供了一种在纤维素降解梭菌体内成功进行基因失活的方法，且此方法在纤维素降解梭菌中进行基因失活的效率可高达95%以上。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对纤维素降解梭菌(Clostridium cellulolyticum)进行有针对性地高效地基因失活的方法。本专利技术所使用的标准菌株是Clostridium cellulolyticum ATCC35319 (HlO),本专利技术所使用的基因转移方法及基因失活载体是根据文献报道、本实验室进行相应改造而来。本专利技术主要是根据细菌二类内含子能够定向、高效的插入到基因特定靶位点的特性，对所选定的基因进行插入失活而达到基因失活的目的。本专利技术以纤维素降解梭菌Ccel2866基因(编码产物为限制性内切酶Msp I，识别酶切位点为CCGG)为失活对象，首次成功实现了纤维素降解梭菌的基因失活。主要内容包括I. 一种纤维素降解梭菌高效基因失活的方法。所述方法包括利用细菌二型内含子进行插入失活所述纤维素降解梭菌细胞内基因的步骤。2.按照以上I的方法，其特征在于所述纤维素降解梭菌是能够利用纤维素产乙醇的梭菌。3.按照以上2的方法，其特征在于所述利用纤维素产乙醇梭菌包括纤维素降解梭菌(Clostriduum cellulolyticum)、食纤维素梭菌(Clostridium cellulovorans)和溶纸梭菌(Clostridium papyrosolvens)。4.按照以上1-3的方法，其特征在于所述定向失活方法包括基于二型内含子LI. ItrB的插入失活。 5.按照以上4的方法，其特征在于所述利用纤维素产乙醇梭菌与遗传转化相关基因的插入失活。6.按照以上5的方法，其所述与遗传转化相关的基因包括限制性修饰系统的基因以及与纤维素降解相关基因。7.按照以上6的方法，其所述限制性修饰系统的基因包括I、II、III和IV型限制性内切酶编码基因。附图说明图1，Ccel2866基因中二类内含子(intron)插入示意图。图2, Ccel2866基因插入PCR验证。WT, C. cellulolyticum野生型菌株为模板；NC,阴性对照，未加模板；plasmid,质粒为模板；泳道1_4及7-9,使用Primer I和2扩增产物；5-6，使用引物 Ccel2866-297/298s-EBS2 和 Primer 2 扩增产物具体实施例方式实施例I Clostridium cellulolyticum HlO 中 Ccel2866 基因的失活细菌细胞内广泛存在限制性修饰系统(Restriction-modification system),它可以识别自身DNA和外源DNA，并通过切割降解外源DNA达到保护自身的目的。基因序列分析和实验验证确定纤维素降解梭菌细胞内含有II型限制性内切酶Msp I，其识别位点为CCGG序列，细菌通过合成Msp I识别外源的非甲基化的CCGG序列，从而将外源DNA进行酶切降解，以达到保护自己的目的。研究表明，失活细菌细胞内的限制性修饰系统，可有效提高基因转化效率。基于二型内含子的回归机制对纤维素降解梭菌Clostridiumcellulolyticum HlO的Msp I限制性内切酶基因进行基因失活。第一步根据文献报道及Genebank基因组数据，确定II型限制性内切酶Msp I的编码基因为Ccel2866，并选定Ccel2866为失活对象。第二步构建Ccel2866基因失活载体。利用网站(http://clostron. com)提供的软件及Perutka算法确定Ccel2866基因序列中的插入位点，选择297/298s处为插入位点，设计引物(表I)。使用Ccel 2866-297/298s-IBS, C c e I 2 8 6 6 - 2 9 7 / 2 9 8 s-EB S I d，Ccel2866-297/298s-EBS2 和 EBS universal 为引物，以 pMTL007 为模版进行 Gene SOEingPCR(基因融合PCR)，将扩增得到353bp的Ccel2866内含子，并插入到基因敲除载体，然后进行酶切验证和测序。基因敲除载体由PMPl衍生而来的，含有来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的 ptb 启动子(phosphotransbutyrylase promoter),基因特异性二型内含子位于Ptb启动子控制之下。第三步质粒的甲基化。用Msp I甲基转移酶对质粒进行体外甲基化，甲基化效率用MspI限制性内切酶进行酶切验证。第四步感受态细胞的制备。感受态细胞制备全过程均在无氧环境下完成。从-80°C冰箱保存的菌种首先在含有滤纸的GS2培养基(每升GS2含KH2PO4 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 3. 8g，尿素 2. lg, MgCl2 · 6H20 I. 0g, CaCl2 · 2H20 150mg, FeSO4 · 6H20 I. 25mg,L-Cysteine-HCl I. Og, MOPS 钠盐 10g，酵母膏 6. Og,朽1 檬酸钠 3. Og, 0. I % 刃天青 lml, pH7.4)中活化，然后按照I 50比例接种到40ml GS2-纤维二糖培养基(GS2中加本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纤维素降解梭菌高效基因失活的方法，所述方法包括：利用细菌二型内含子进行插入失活所述纤维素降解梭菌细胞内基因的步骤。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔球，崔古贞，洪伟，刘亚君，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
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