本发明专利技术公开了一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法。该方法是将目的片段与表达载体相连得到重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化进入丙酮丁醇梭菌中，从而得到高产丁醇的重组菌株；所述的目的片段为表达盒EC或丁醇脱氢酶基因bdh；或表达盒EC、丁醇脱氢酶基因bdh和操纵子Sol中两者或三者的结合；所述的表达盒EC，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.11所示；所述的操纵子Sol，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.16所示；所述的丁醇脱氢酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.20所示。本发明专利技术重组菌株能够表达丁醇产生菌丁醇生物合成基因编码的丁醇生物合成酶，从而使丁醇生物合成酶的活性提高，菌株的代谢强度得到提高，丁醇的产量和转化率可得到进一步提高，有利于丁醇的工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物工程
，具体涉及。
技术介绍
丁醇是一种重要的化工原料，主要用于增塑剂、溶剂、萃取剂等。近年来发现丁醇的热值、辛烷值与汽油相当，且能与汽油以任意比混合，可以使用现有的石油管道运输方式，丁醇已成为被世界各国企业和研究机构强烈关注的一种极具潜力的新型生物燃料。丁醇主要有发酵和石油化工合成的方法生产。发酵法是粮食或其它淀粉质农副产品，经水解得到发酵液，然后在丙酮、丁醇梭菌作用下，经发酵制得丙酮、丁醇和乙醇的混合物，通常的比例为3 6 :1，再经精馏得到相应产品。80年代起石油化工业的迅猛发展，发酵法无法与以丙烯为原料的羰基合成法竞争，因此很少采用该方法生产丁醇产品。但是，近年来由于石油价格的飞速上涨，加之石油资源的日益紧缺，导致原油价格的持续上涨，通过石油化工方法生产丁醇、丙酮的成本大大提高，发酵法生产丙酮、丁醇的技术重新显示出其优势，特别是发酵法生产丙酮丁醇是以可再生资源替代不可再生的石油基原料制造，符合国家能源安全的长远战略。与化学合成法相比，发酵法具有以下优势I)化工合成法以石油为原料，投资大，技术设备要求高；而微生物发酵法一般以淀粉质、纸浆废液、糖蜜和木质纤维素等为原料，其工艺设备与酒精生产相似，原料价廉，来源广泛，设备投资较小；2)发酵法生产条件温和，一般常温操作，不需贵重金属催化剂；3)选择性好、安全性高、副产物少，易于分离纯化；4)降低了对有限石油资源的消耗和依赖。但目前，丁醇发酵缺乏经济竞争力，其主要原因是1)用作发酵的碳源成本偏高；2)发酵液中的丁醇浓度低；3)发酵过程中的丁醇选择性不高。为了解决上述问题，使发酵法在经济上具有较好的竞争能力，自上世纪六十年代以来，世界各国研究工作者在菌种改造、发酵原料、代谢途径、产物分离等方面进行了大量研究，我国工作者也对丙酮丁醇发酵进行了一系列探索。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术将丁醇产生菌的丁醇生物合成途径的酶的基因克隆进入丙酮丁醇梭菌中，使丁醇生物合成途径的酶过量表达，以提高丁醇的产量，从而实现了本专利技术的目的。本专利技术的高产丁醇的重组菌株是通过以下方法构建的，包括以下步骤将目的片段与表达载体相连得到重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化进入丙 酮丁醇梭菌中，从而得到高产丁醇的重组菌株；所述的目的片段为表达盒EC或丁醇脱氢酶基因bdh ;或表达盒EC、丁醇脱氢酶基因bdh和操纵子Sol中两者或三者的结合；所述的表达盒EC，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示；所述的操纵子Sol，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示；所述的丁醇脱氢酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示。所述的表达盒EC具体是将氯霉素启动子Pcm、β -羟丁酰-Cok脱氢酶基因hbd(其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示)、乙酰-CoA乙酰基转移酶(硫解酶)基因thl的自身启动子Pthl、乙酰-CoA乙酰基转移酶(硫解酶)基因thl (其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示)、β -羟丁酰-CoA脱水酶(巴豆酸酶)基因crt的自身启动子Pert、β -羟丁酰-CoA脱水酶(巴豆酸酶)基因crt (其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 14所示)、丁酰-Cok脱氢酶基因bed (其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示)顺序相连，得到表达盒EC。 所述的操纵子Sol具体是将操纵子Sol启动子Psoll、Psol2、醇脱氢酶基因adhE(其编码蛋白的序列如SEQ ID NO. 17所示)、酰基-CoA转移酶基因CtfA (其编码蛋白的序列如SEQ ID NO. 18所示)、ctfB (其编码蛋白的序列如SEQ ID NO. 19所示)顺序连接，得到操纵子Sol。所述的丁醇脱氢酶基因bdh具体是将丁醇脱氢酶基因bdhA自身启动子PbdhA、丁醇脱氢酶基因bdhA(其编码蛋白的序列如SEQ ID NO. 21所示)、bdhB自身启动子PbdhB、丁醇脱氢酶基因bdhB (其编码蛋白的序列如SEQ ID NO. 22所示)顺序连接，得到丁醇脱氢酶基因bdh。所述的表达载体优选为表达载体pMPl。所述的丙酮丁醇梭菌包括但不限于Clostridium acetobutylicum CICC8008、CICC8011、CICC8012、CICC8016、CICC8017和美国典型微生物菌种保藏中心ATCC所保藏的丙酮丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum 或 Clostridium saccharobutylacetonicum或 Clostridium beijerinkii)ATCC 824、ATCC 3625、ATCC 4259、ATCC 8529、ATCC 10132、ATCC 25752、ATCC 27021、ATCC 35702、ATCC 39057、ATCC 39058、ATCC 39236、ATCC 43084、ATCC51743、ATCC 55025、ATCC 824D-5、BAA-117。本专利技术的第二个目的是提供本专利技术的高产丁醇的重组菌株在以淀粉类或糖类为原料生产丁醇中的应用。本专利技术的高产丁醇的重组菌株的培养可采用常规方法进行培养，采用典型培养基，其中含有碳源、氮源、矿物质、以及所需要的诸如氨基酸、维生素等微量有机营养物。另夕卜，合成或天然的培养基均可采用。只要菌株可以利用以进行培养，任何碳源和氮源均可采用。就碳源而言，诸如淀粉类、葡萄糖、木糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、纤维素水解液、半纤维素水解液、淀粉水解物、糖蜜等糖类，以及诸如醋酸、柠檬酸等有机酸均可采用。就有机微量营养而言，氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，酵母提取物，麸皮、豆柏、玉米浆、大豆蛋白分解产物等物质均可采用。当某种营养缺陷型突变株的生长需要一种氨基酸或类似的物质时，优先添加该需要营养物。就矿物质而言，磷酸盐、镁盐、钙盐、锰盐等等均可采用。培养方式为发酵温度为30 42°C单釜或连续发酵，发酵时间36 108h，培养基中就会积累大量的丁醇。培养结束后，可以釆用常规蒸馏方法从发酵培养基中收集丁醇。利用本专利技术的方法构建的重组菌株，其能够表达丁醇产生菌丁醇生物合成基因编码的丁醇生物合成酶，从而使丁醇生物合成酶的活性提高，菌株的代谢强度得到提高，丁醇的产量和转化率可得到进一步提高，有利于丁醇的工业化生产，具有广阔的应用前景。附图说明图I是丁醇生物合成途径不意图，图中ldh，乳酸脱氢酶lactate dehydrogenase ；pdc，丙酮酸脱羧酶 pyruvate decarboxylase ;hyd，氢化酶 hydrogenase ;pfor，丙酮酸铁氧化还原蛋白氧化还原酶pyruvate:ferredoxin oxidoreductase ;thl，乙酸-CoA乙酉先基转移酶(硫解酶)acetyl-CoAacetyltransferase (thiolase) ;hbd，β _ 轻丁酉先-CoA 脱氢酶 β -hydroxybutyryI-CoA dehydrogenase ；crt, β -轻丁酉先-CoA 脱水 酶(巴豆酸酶)3-hydroxybu本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高产丁醇的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 将目的片段与表达载体相连得到重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化进入丙酮丁醇梭菌中，从而得到高产丁醇的重组菌株； 所述的目的片段为表达盒EC或丁醇脱氢酶基因bdh ;或表达盒EC、丁醇脱氢酶基因bdh和操纵子Sol中两者或三者的结合； 所述的表达盒EC，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示； 所述的操纵子Sol，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示； 所述的丁醇脱氢酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示。2.根据权利要求I所述的构建方法，其特征在于，所述的表达载体为表达载体pIMPl。3.根据权利要求I所述的构建方法，其特征在于，所述的丙酮丁醇梭菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈新德，侯小虎，熊莲，黄超，张海荣，陈雪芳，
申请(专利权)人：中国科学院广州能源研究所，
类型：发明
国别省市：
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