提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法技术

提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，涉及一种提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法。本发明专利技术是要解决现有大豆根瘤菌基因工程菌株在接种到大豆幼苗后，与原始出发菌株相比，大豆植株所结根瘤数及大豆产量增幅小的问题。方法：对费氏中华根瘤菌进行活化和扩培，提取基因组DNA；采用同源序列克隆法，PCR扩增，获得目的基因dctA；对目的基因进行测序鉴定；构建重组载体pET-Plac-dctA；然后构建原核生物表达载体pTR-Plac-dctA；六、将原核生物表达载体转化到费氏中华根瘤菌中，即获得基因工程菌株。转化本发明专利技术基因工程菌株的大豆植株所结根瘤数增加53.73％，大豆产量增加62.02％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。
技术介绍
氮素是自然界中动物、植物、微生物中不可缺少的生命元素，在活细胞内，氮是所有氨基酸、核酸及其他许多重要分子的主要组成部分。大气中的氮，必须通过以生物固氮为主的固氮作用，才能被植物吸收利用，动物直接或间接地以植物为食物才能吸收利用氮素。生物固氮是指某些种类的固氮微生物利用体内的固氮酶在常温常压下将大气中的氮还原成氨的过程。根据固氮微生物的固氮特点以及与植物的关系，可以将生物固氮作用分为自生固氮、共生固氮和联合固氮三类。大豆根瘤菌是共生固氮微生物中的一类，与宿主植物形成共生固氮体系后进行生物固氮，为宿主植物提供生长所必需的氮元素。统计表明，在3种 固氮形式中，共生固氮效率最高，固氮量最多。长期以来，人们把豆科植物根瘤的固氮作用视为粮食生产的基础，它既可保持土壤肥力，又可提高粮食作物的产量。生物固氮仍然是生命科学研究中的重大课题，而且在农业生产中也具有重要的应用价值。生物固氮不仅固氮量大，而且还可以提高土壤肥力，改善土壤板结情况，减少化肥的使用量，不污染环境；更为重要的是它有取之不尽，用之不竭的廉价氮源，常温常压下可以固氮，成本低，利用率高，因此，生物固氮是今后肥料发展的主要方向之一。黑龙江省是我国大豆的主产区，年播种面积、总产量和出口量均居全国首位，加强生物固氮作用的研究及应用对提高我省大豆的产量有重要意义。目前,大豆根瘤菌基因工程菌株在接种到大豆幼苗后，与原始出发菌株相比，大豆植株所结根瘤数增加23. 73%，大豆产量增加3. 8% 51. 39%，增幅较小。
技术实现思路
本专利技术是要解决现有大豆根瘤菌基因工程菌株在接种到大豆幼苗后，与原始出发菌株相比，大豆植株所结根瘤数及大豆产量增幅小的问题，提供一种。本专利技术，按以下步骤进行一、对费氏中华根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取费氏中华根瘤菌15067的基因组DNA;二、采用同源序列克隆法，以费氏中华根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，将扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒TaKaRa Agarose GeL DNA Purification Kit进行纯化，获得目的基因dctA ;三、对目的基因dctA进行测序鉴定；四、将目的基因dctA与重组质粒载体PET-Plae分别经NdeI和BamHI进行双酶切，将酶切后的目的基因dctA和酶切后的载体pET_Pla。连接，获得重组载体pET-Plae-dctA ;五、以重组载体pET-Plae-dctA为模板进行PCR扩增，构建Pla。-dctA_T7片段，然后将Pla。-dctA-17片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，将酶切后的Plac-dctA-I7片段和酶切后的pTR102质粒载体连接，构建原核生物表达载体pTR-Plae-dctA ；六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-Plae-dctA转化到费氏中华根瘤菌15067中，即获得基因工程菌株HD-SF-04 ;其中步骤二中PCR扩增所用上游引物Pl为5' -CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC-3'，下游引物 P2 为 5' -GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC-3';步骤五中PCR扩增所用上游引物P3为5' -CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3'，下游引物 P4 为 5' -CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA-3'。大量的研究结果已经表明，苹果酸、延胡索酸和琥珀酸等四碳二羧酸(dCAs)是植物体直接供给类菌体以支持其共生固氮所需要的碳源及能源。增强四碳二羧酸转移酶基因(dctABD)的表达可以增强宿主植物体的光合产物向类菌体的传递，从而以满足其氨类物质的同化吸收过程和固氮作用对碳源及能量的需求。四碳二羧酸转移酶基因dctABD是植物类菌体在共生固氮时所必需的基因，其结构基因dctA编码四碳二羧酸转移酶，并且受调控于调节基因dctB和dctD，其中dctA基因和dctB、dctD基因呈现出反向的排列结构。本专利技术获得的基因工程菌株HD-SF-04与出发菌株及含空载体pTR102的菌株相t匕，接种转基因工程菌株HD-SF-04的大豆植株所结根瘤的固氮酶活性增加约37%，大豆 植株所结根瘤数增加53. 73%，大豆产量上增加约62. 02%。本专利技术所构建的工程菌株HD-SF-04对黑龙江省大豆生产的实际需求有很大的现实意义。附图说明图I为具体实施方式一步骤一中PCR扩增获得的目的基因dctA电泳图；图2为具体实施方式一步骤四中重组质粒载体PET-Pla。双酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳检测图；图3为具体实施方式一基因工程菌株HD-SF-04的菌落发光性检测图。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式，按以下步骤进行一、对费氏中华根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取费氏中华根瘤菌15067的基因组DNA;二、采用同源序列克隆法，以费氏中华根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，将扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因dctA ;三、对目的基因dctA进行测序鉴定；四、将目的基因dctA与重组质粒载体PET-Plae分别经NdeI和BamHI进行双酶切，将酶切后的目的基因dctA和酶切后的载体PET-Plae连接，获得重组载体pET-Plae-dctA ;五、以重组载体pET-Plae-dctA为模板进行PCR扩增，构建Pla。-dctA-17片段，然后将Pla。-dctA-17片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，将酶切后的Pla。-dctA-17片段和酶切后的PTR102质粒载体连接，构建原核生物表达载体pTR-Plac;-dCtA ;六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-Plae-dctA转化到费氏中华根瘤菌15067中，即获得基因工程菌株HD-SF-04 ;其中步骤二中 PCR 扩增所用上游引物 PI 为 5' -CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC-3'，下游引物 P2为 5 ' -GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC-3 ';步骤五中 PCR 扩增所用上游引物 P3 为5' -CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3'，下游引物 P4 为 5' -CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA_31 o步骤一中费氏中华根瘤菌15067购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)菌种保藏编号是ACCC15067，在中国农业微生物菌种保藏管理中心仍处于可用状态。步骤二中所述胶回收试剂盒为购买自TaKaRa公司的琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(TaKaRa Agarose GeL DNA Purification Kit)。步骤四中重组质粒载体pET_Pla。的构建方法为采用聚合酶链式反应向Iac启动子片段两端各引入Bgl II和Nco I酶切位点，对Iac启动子的PCR产物与载体pET-28a(购买自Novagen公司)分别经Bg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行 一、对费氏中华根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取费氏中华根瘤菌15067的基因组DNA ;二、采用同源序列克隆法，以费氏中华根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，将扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因dctA ;三、对目的基因dctA进行测序鉴定；四、将目的基因dctA与重组质粒载体PET-Plae分别经NdeI和BamHI进行双酶切，将酶切后的目的基因dctA和酶切后的载体PET-Plae连接，获得重组载体pET-Plae-dctA ;五、以重组载体pET-Plae-dctA为模板进行PCR扩增，构建Pla。-dctA-17片段，然后将Pla。-dctA-17片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，将酶切后的Pla。-dctA-17片段和酶切后的PTR102质粒载体连接，构建原核生物表达载体pTR-Plac;-dCtA ;六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-Plae-dctA转化到费氏中华根瘤菌15067中，即获得基因工程菌株HD-SF-04 ;其中步骤二中 PCR 扩增所用上游引物 PI 为 5' -CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC-3'，下游引物 P2为 5 ' -GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC-3 ';步骤五中 PCR 扩增所用上游引物 P3 为5' -CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3'，下游引物 P4 为 5' -CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA_3' o2.根据权利要求I所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的反应体系如下 成分用量400ng/jiL费氏中华根瘤菌15067基因组DNA0 5^L 0.2(^M 引物 PlI.OpL 0.2(iM 引物 P21.0|iL \0^1-xTaq 缓冲液2.0|iL lOmmol/L dNTP1.5|iL Ex Taq DNA 聚合酶0.5|iL 无菌水13.5pL PCR扩增条件为94°C变性5min，94°C变性30s，54。。退火30s，72。。延伸90s，共35个循环，再72°C延伸7min,4°C保温。3.根据权利要求I所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中目的基因dctA的双酶切反应体系如下成分用量目的基因次以IO.O|.iL 限制性内切酶AfefeI 1.0|iL 限制性内切酶Bamm 1.0|iL...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海英，于冰，蒙明明，陈思学，马春泉，李珊珊，杨乐，贾珊珊，季琳，吴川，潘钰，宫世龙，王琳琳，谷丹，赵晨曦，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：