一种以大豆慢生根瘤菌全细胞拆分消旋体β‑内酰胺的方法技术

一种以大豆慢生根瘤菌全细胞拆分消旋体β‑内酰胺的方法，属于分离技术领域。大豆慢生根瘤菌全细胞转化拆分3‑羟基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮、3‑乙酰氧基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮具有非常高的催化效率，能够获得具有较高纯度的单一构型化合物。其中，（3R,4S）3‑羟基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮e.e值为99.99%，目标产物相对收率99%，总收率49.5%；（3R,4S）3‑乙酰氧基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮e.e值为99.88%，目标产物相对收率93.58%，总收率46.79%。

【技术实现步骤摘要】
一种以大豆慢生根瘤菌全细胞拆分消旋体β-内酰胺的方法
本专利技术具体涉及一种以大豆慢生根瘤菌为生物催化剂，拆分消旋体3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮、消旋体3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮的全细胞转化方法，属于分离

技术介绍
(3R,4S)-3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮，简称(-)β-内酰胺，它是一种非常具有潜力的手性药物中间体，它有两种异构体即（3R,4S）构型和（3S,4R），其中（3R,4S）构型的异构体的衍生物紫杉醇侧链C-13是制备癌症临床化疗最具应用前景的新药之一多西紫杉醇的重要手性前体。3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮是对应于3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮的乙酰化产物，可将其进行去乙酰化得到3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮。目前人工半合成紫杉醇主要原料由10-去乙酰巴卡汀III与紫杉醇侧链13组成。由于当前10-去乙酰巴卡汀III已可相对较容易的从欧洲紫杉针叶中大量可持续的获取，因此获得单一立体构型的(-)β-内酰胺及其结构类似物是人工半合成紫杉醇的工艺关键。而目前报道的获得手性纯(-)β-内酰胺的方法多是通过有机合成途径，反应步骤较多且操作相对繁琐。已报道的可用于生物酶法拆分外消旋体3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮的酶及微生物仍非常有限。利用大豆慢生根瘤菌全细胞拆分消旋体3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮、3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮，能够获得高光学纯度的(-)β-内酰胺，这一发现具有非常大的应用价值。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题之一是公开一种以大豆慢生根瘤菌为生物催化剂，全细胞转化生产(3R,4S)-3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮及(3R,4S)3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮的方法。本专利技术用于转化生产(-)β-内酰胺的微生物是一种大豆慢生根瘤菌，为常规的，又名日本慢生根瘤菌。本专利技术利用大豆慢生根瘤菌全细胞转化消旋体β-内酰胺制备(-)β-内酰胺的方法，是通过以下技术方案实现的：（1）菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobiumjaponicum）作为菌种；（2）发酵液制备：将保存的大豆慢生根瘤菌菌种接种至根瘤菌无菌液体培养基中，振荡培养，获得菌株发酵液；（3）菌体收集：将上述的菌株发酵液与pH值为7.0的磷酸盐缓冲液进行混合，得到稀释发酵液；将稀释发酵液进行多次离心，收集菌体沉淀；将菌体沉淀用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液再次洗涤处理，回收得到湿菌体作为生物催化剂；（4）生物拆分反应：将步骤（3）得到的湿菌体与消旋体β-内酰胺混合，制得菌体混合液，振荡培养，得到反应液；（5）样品分离：将步骤（4）所述的反应液充分离心，除去菌体，得到上清液，有机溶剂萃取所得物质即为(-)β-内酰胺。上述的大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobiumjaponicum），为常规的，可以购买，如来自（菌种保藏号CGMCC：1.2550）。培养基为常规的根瘤菌无菌液体培养基，参考中国普通微生物菌种保藏管理中心根瘤菌培养基，编号0009，根瘤菌无菌液体培养基组成包括：氮源：碳源：土壤提取液：蒸馏水为1.0g：10.0g：200ml：800ml，pH7.2；其中土壤提取液：每25g土壤，加去离子水100ml，105kPa蒸煮1小时，过滤后加水补足到蒸煮前体积；具体制备方法为：将氮源、碳源、土壤提取液溶于去离子水，以NaOH调PH值至7.2，于121kPa灭菌20min，得到所述的根瘤菌发酵培养基；根瘤菌液体培养基的碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖中的一种或几种的混合物；氮源包括胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆中的一种或几种的混合物。所述的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液由0.05MNa2HPO4：0.05MNaH2PO4体积比7:3混合而成。步骤（2）中所述的大豆慢生根瘤菌菌种以0.1%～0.5%的体积比接种到根瘤菌培养基中，20℃～30℃，振荡培养96～168h。步骤（3）菌株发酵液与pH值为7.0的磷酸盐缓冲液的混合体积比优选为1:1；步骤（4）所述的湿菌体与1～10g/L消旋体β-内酰胺溶液混合，得到菌体混合液，其中优选每500ul反应体系中包含60mg湿菌体；所述的消旋体β-内酰胺溶液为消旋体β-内酰胺与通用缓冲液，经过超声培养处理后制得；所述的通用缓冲液为三羟甲基氨基甲烷（Tris）50mM；硼酸50mM；柠檬酸33mM；Na3PO450mM。用HCl或NaOH调pH3～12。所述的振荡培养的温度为25℃～50℃，pH值5.0～10.0条件下，时间为3h～24h。优选培养温度：25～35℃，更适宜温度：28℃。培养方式：有氧条件下振荡培养。上述的有机溶剂优选为乙酸乙酯；上述所述的消旋体β-内酰胺为3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮全细胞拆分后对应于步骤（6）中的(-)β-内酰胺为(3R,4S)-3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮。上述所述的消旋体β-内酰胺为3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮全细胞拆分后对应于步骤（6）的(-)β-内酰胺为（3R,4S）3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮。本专利技术的特点：本专利技术首次采用生物催化法拆分所述的消旋体β-内酰胺，较之现有的有机合成途径，环境污染小，反应效率高。本专利技术首次采用大豆慢生根瘤菌全细胞拆分所述的消旋体β-内酰胺，大豆慢生根瘤菌中的（+）γ-内酰胺酶催化效率高，得到的单一构型化合物(-)β-内酰胺纯度高。大豆慢生根瘤菌全细胞转化拆分3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮、3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮具有非常高的催化效率，能够获得具有较高纯度的单一构型化合物。其中，（3R,4S）3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮e.e值为99.99%，目标产物相对收率99%，总收率49.5%；（3R,4S）3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮e.e值为99.88%，目标产物相对收率93.58%，总收率46.79%。附图说明图1是实施例2中外消旋3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮的手性HPLC图谱。图2是实施例2中大豆慢生根瘤菌拆分3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮后的手性HPLC图谱。图3是标准品消旋体3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮的手性HPLC图谱。图4是标准品（3R,4S）3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮的手性HPLC图谱。图5是实施例2中外消旋3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮的手性HPLC图谱。图6是实施例2中大豆慢生根瘤菌拆分3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮后的手性HPLC图谱。图7是标准品消旋体3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮的手性HPLC图谱。图8是标准品（3R,4S）3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮的手性HPLC图谱。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术并不限于以下是实施例。实施例1：本实施例为一种大豆慢生根瘤菌全细胞拆分3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮。该方法包括如下步骤：（1）菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobiumjaponicum）作为菌种，菌种保藏号为CGMCCNo.1.2550；该菌种保藏于-80℃；（2）发酵液制备：将所述的大豆慢生根瘤菌菌种以0.1%～0.5%的体积比接种到根瘤菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用大豆慢生根瘤菌全细胞转化消旋体β‑内酰胺制备(‑)β‑内酰胺的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）作为菌种；（2）发酵液制备：将保存的大豆慢生根瘤菌菌种接种至根瘤菌无菌液体培养基中，振荡培养，获得菌株发酵液；（3）菌体收集：将上述的菌株发酵液与pH值为7.0的磷酸盐缓冲液进行混合，得到稀释发酵液；将稀释发酵液进行多次离心，收集菌体沉淀；将菌体沉淀用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液再次洗涤处理，回收得到湿菌体作为生物催化剂；（4）生物拆分反应：将步骤（3）得到的湿菌体与消旋体β‑内酰胺混合，制得菌体混合液，振荡培养，得到反应液；（5）样品分离：将步骤（4）所述的反应液充分离心，除去菌体，得到上清液，有机溶剂萃取所得物质即为(‑)β‑内酰胺。

【技术特征摘要】
1.利用大豆慢生根瘤菌全细胞转化消旋体β-内酰胺制备(-)β-内酰胺的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)作为菌种；菌种保藏号为CGMCCNo.1.2550；(2)发酵液制备：将保存的大豆慢生根瘤菌菌种接种至根瘤菌无菌液体培养基中，振荡培养，获得菌株发酵液；(3)菌体收集：将上述的菌株发酵液与pH值为7.0的磷酸盐缓冲液进行混合，得到稀释发酵液；将稀释发酵液进行多次离心，收集菌体沉淀；将菌体沉淀用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液再次洗涤处理，回收得到湿菌体作为生物催化剂；(4)生物拆分反应：将步骤(3)得到的湿菌体与消旋体β-内酰胺混合，制得菌体混合液，振荡培养，得到反应液；(5)样品分离：将步骤(4)所述的反应液充分离心，除去菌体，得到上清液，有机溶剂萃取所得物质即为(-)β-内酰胺；所述的消旋体β-内酰胺为3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮全细胞拆分后对应于(-)β-内酰胺为(3R,4S)-3-羟基-4-苯基-2-氮杂环丁酮；或所述的消旋体β-内酰胺为3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮全细胞拆分后对应于(-)β-内酰胺为(3R,4S)3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮杂环丁酮；根瘤菌无菌液体培养基组成包括：氮源：碳源：土壤提取液：蒸馏水为1.0g：10.0g：200ml：800ml，pH7.2；其中土壤提取液：每25g土壤，加去离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑国钧，宋大伟，陈清，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11