本发明专利技术涉及一个从刺槐根瘤中分离的、有ACC脱氨酶能高效结瘤并促进刺槐生长的中慢生根瘤菌KDRM185及其应用。该中慢生根瘤菌KDRM185菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2012329。本发明专利技术所述的中慢生根瘤菌KDRM185有ACC脱氨酶，能将ACC分解成α-酮丁酸和NH3，降低植物细胞合成乙烯的水平，减轻乙烯对根瘤菌侵染的抑制作用，提高根瘤菌与刺槐的结瘤率和共生固氮的水平，为刺槐在不施肥的贫瘠荒地上生长提供高水平的氮素，促进刺槐苗生长，增加刺槐成材的生物量，从而用低成本的接种投入让刺槐成材高产，在刺槐育苗造林上发挥作用。
【技术实现步骤摘要】
中慢生根瘤菌KDRM185及其应用
本专利技术属于应用微生物学领域，具体涉及一个从刺槐根瘤中分离的、有ACC脱氨酶能高效结瘤并促进刺槐生长的中慢生根瘤菌KDRM185及其应用。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO M 2012329，菌株名为中慢生根瘤菌 KDRM185。
技术介绍
自然界中有些原核微生物能合成固氮酶，在常温常压下，将空气中的N2还原成 NH3。由固氮微生物固定的氮素约占地表化合态氮的65% - 70%，其中以根瘤菌与豆科植物共生体系固氮能力最强，占生物固氮量的65%以上。利用根瘤菌与豆科植物共生固氮提高土壤肥力和农作物产量是世界农业的经典经验。如用豆科植物作绿肥，让豆科与非豆科作物轮作、间作和套作。通过接种根瘤菌提高豆科作物的共生固氮效率和产量及土壤肥力已有100多年历史，广泛为各农业大国所用， 是当今发展可持续农业的重要措施之一。20世纪80年代以来，我国粮食作物的种植面积不断扩大，豆科作物和豆科绿肥的种植面积不断减少，化肥尤其是氮肥用量不断增加。由于高水平化合态氮阻遏根瘤菌结瘤固氮，接种根瘤菌的结瘤固氮效应在施用大量氮肥的农田里急剧下降，根瘤菌接种事业的发展随之被遏制。进入21世纪，中国实施西部大开发战略和退耕还林还草工程，为扩大豆科树种、牧草的种植面积和加强与之相匹配的根瘤菌接种技术应用提供了契机。刺槐(TPoAiflia pseudoacacia L.)又称洋槐,是落叶乔木,高10 - 25米,木质坚硬，有弹性，抗磨损，是良好矿柱、枕木、建筑用材。刺槐原产美国东部，引种入欧洲后，于十九世纪末再从欧洲引入中国。刺槐生长快，分布越来越广，一方面得益于刺槐适应性强， 能在酸性土、中性土和含盐量O. 3%以下的盐碱土中生长，有一定的耐旱能力；另一方面刺槐是豆科植物，可以与根瘤菌共生固氮而获取生长所必需的氮素，从而适于在贫瘠的土地生长。种植刺槐的生态效应，如保持水土、改良土壤等，也非常显著。因此，刺槐成为全世界最重要的速生造林先锋树种之一，也是我国退耕还林工程的先锋树种。随着全球石油、煤炭和天然气等矿物能源的日益枯竭，开发利用可再生的生物质能源以取代矿物能源越来越为世界各国政府所关注。目前，中国经济快速增长，矿物能源消耗量急剧增长，能源短缺问题十分突出，生物质能源等可再生能源的开发和利用已成为实现可持续发展的关键。生物质能源的开发和利用的基点在于原料生产，原料成本占总成本的60% - 80%，原料成本决定产品的市场竞争力和利润。林木是生物质能源的重要原料。刺槐凭借其热值高，生长速度快和耐瘠抗逆等特点，成为重要的生物质能源树种。在贫瘠荒地上，用少施肥、低成本的投入产出高的成材生物量是目前我国刺槐能源林生产的瓶颈问题。用高效结瘤固氮的根瘤菌接种刺槐苗，通过共生固氮使树苗在贫瘠的土地上获得氮素成材，可能提高刺槐造林效率和降低原料成本。 目前，一方面，在技术上，现代刺槐造林通过大规模苗圃育苗提高造林效率，为刺槐苗人工接种根瘤菌创造了便利条件。另一方面，限于技术和管理上的制约，我国的大规模造林还没有向林业发达国家那样实施以氮素为主的大规模施肥，但不施肥反而为刺槐与根瘤菌的共生固氮创造了没有氮阻遏的条件，有利于提高共生固氮的效率。刺槐适应贫瘠土壤能力强的一个因素是它能与多个属种的遗传多样的根瘤菌共生固氮。已发现能与刺槐结瘤的主要是中慢生根瘤菌属的根瘤菌,还有中华根瘤菌属(Sinorhizobia )、根瘤菌属(/Sizobium )和慢生根瘤菌属iBradyrhizobium ) 等属的根瘤菌。根瘤菌与刺槐结瘤固氮的能力高低不一，利用接种根瘤菌促进刺槐生长需要选择高效的根瘤菌菌株。通常筛选优良根瘤菌菌株是通过从多个大且饱满的刺槐根瘤中分离多个根瘤菌菌株，逐一接种刺槐苗，培养2个月或更长时间后，检测刺槐苗根部的结瘤数和苗的生物量；而要从数量较多的菌株中筛选出高效结瘤固氮的根瘤菌菌株要靠碰运气，筛选过程费时费力。根瘤菌侵染豆科植物的根会引发植物产生植物激素乙烯及合成乙烯的前体 I-氨基环丙烷-I羧酸(ACC)，而乙烯会抑制根瘤菌结瘤和固氮。近年来的研究发现有些根瘤菌有ACC脱氨酶。ACC脱氨酶能催化ACC脱氨基反应，生成α-酮丁酸和NH3。根瘤菌侵染根时，根细胞合成ACC并释放部分ACC到细胞外。有ACC脱氨酶的根瘤菌能吸收并降解植物细胞释放的ACC，使根细胞中的ACC不断释放而减少，根细胞合成乙烯的量就相应减少，从而降低了乙烯对根瘤菌侵染结瘤的抑制作用。如果把根瘤菌的ACC 脱氨酶结构基因CacoSO敲除，根瘤菌的结瘤能力会显著降低(Uchiumi等，Journal of Bacteriology 2004, 186:2439-2448);相反，如果向原本没有acoS1的根瘤菌导入acoU, 那根瘤菌工程菌的结瘤率、占瘤率和固氮效率显著高于野生型菌株(Ma等，Applied and Environmental Microbiology 2004, 70:5891-5897 ;Conforte 等，Journal of General and Applied Microbiology 2010, 56:331-338; Tittabutr 等，Systematic and Applied Microbiology 2008, 31:141-150; Nascimento Letters in Applied Microbiology 2012，55:15-21)。这表明有ACC脱氨酶的根瘤菌有强的侵染力，能高效结瘤。根瘤菌调控 ACC脱氨酶的机制比较复杂。研究已发现很多有^必的中慢生根瘤菌属的根瘤菌在自由培养状态下不表达aci/S，没有ACC脱氨酶活性，但在根瘤中会高水平地表达aci/S，发挥ACC脱氨酶的作用(Ma 等，Antonie van Leeuwenhoek 2003, 83:285-291 ;Nukui 等，Applied and Environmental Microbiology 2006, 72:4964-4969 ;Nascimento 等，FEMS Microbiology Letters 2012, 336:26-37)。因此，筛选有ACC脱氨酶的根瘤菌时，如果检测自由培养状态下根瘤菌的ACC脱氨酶活性，对很多根瘤菌尤其是中慢生根瘤菌会失效，而用聚合酶链式反应(PCR)检测根瘤菌有无aci/S基因会更有效。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足而提供一个从刺槐根瘤中分离的、有ACC脱氨酶能高效结瘤并促进刺槐生长的中慢生根瘤菌KDRM185及其应用。本专利技术实现上述技术目的所采用的技术方案如下先用常规方法从刺槐根瘤中分离和纯化根瘤菌，再从根瘤菌基因组中扩增基因， 对扩增出的目标片段测序确定菌株有无基因和ACC脱氨酶，再用有ACC脱氨酶的根瘤菌菌株接种刺槐幼苗，在接种3个月后检测结瘤数、植株的株高、地径和干重，选出能高效结瘤、显著促进刺槐苗生长和提高植株生物量的根瘤菌菌株用于育苗造林。另一方面，扩增有ACC脱氨酶根瘤菌的16S rRNA基因并测序，通过序列比对和系统发育分析16S rRNA基因序列确定菌株的分类归本文档来自技高网...
【技术保护点】
中慢生根瘤菌KDRM185，其特征在于：它已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?NO：M?2012329。
【技术特征摘要】
1.中慢生根瘤菌KDRM185，其特征在于它已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC ...
【专利技术属性】
技术研发人员：李江川，李万里，张继泰，
申请(专利权)人：中盈长江国际新能源投资有限公司，
类型：发明
国别省市：
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