本发明专利技术公开了一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法，是采用三亲本杂交方法获得携带青色荧光CFP特性的內源荧光标记根瘤菌R.GN5f菌液，添加的天然植物源抑菌剂苦参碱混合接种生殖生长期的甘农5号紫花苜蓿根部。本发明专利技术的有益效果为：1）目标根瘤菌R.GN5f通过三亲本杂交获得，遗传稳定性好，获得容易，使用方便；2）苦参碱，对空气源和土壤源微生物抑制，对根瘤菌无抑制作用，促进根瘤菌在苜蓿体内的运移和定殖；且价格低廉，对环境无毒无害；3）获得含苦参碱的荧光标记根瘤菌液容易，接种操作简单，耗时短，适宜生长时期内可随时接种；4）添加苦参碱后促进了目标根瘤菌的运移和定殖，为获得携带有大量目标根瘤菌种子奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】-种目标根瘤菌在首清植株体内运移和定殖的巧进方法
本专利技术设及一种目标根瘤菌在首猜植株体内运移和定殖的促进方法。
技术介绍
根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用不仅具有巨大的经济和社会效益，同时在在农 业生产中，人工接种根瘤菌来促进作物生长和提高种子产量也成为一种常见的农业措施。 但由于植物种类与根瘤菌种类及外在特殊的自然环境、接种方法、与±著根瘤菌的竞争及 多种生物与非生物的胁迫均可影响接种根瘤菌的竞争结瘤能力，使部分根瘤菌难W高效地 进行结瘤固氮，难W达到应有的增产效果。已有研究发现首猜种子携带有的内生根瘤菌与 ±著根瘤菌相比，在结瘤竞争方面有明显的优势。种子及植株体内的根瘤菌属于内生菌范 畴，内生菌的接种方式及植物体的健康状况对内生菌在植物体内的成功定殖与功能发挥起 着决定性作用。但目前，对根瘤菌在首猜植株体内运移进入种子的途径和种子内定殖机理 及影响根瘤菌在植株及种子内运移定殖等研究较少。研究发现营养生长期首猜由茎中部注 射接种标记菌时，IAA对内源菌的运移有促进。同时发现采用根系回接与切根浸根瘤重栽接 种根瘤菌菌液相比，切根瘤重栽接种能使更多标记根瘤菌进入首猜根部。由此说明筛选促 进营养生长期首猜体内目标根瘤菌的方法对导入目标根瘤菌具有一定指导意义，但筛选的 接种方法是否同样利于生殖生长期的首猜还有待进一步验证。而对于首猜-根瘤菌组合体 育种的例子也只初步做了营养生长期的研究报道，目前国内外关于该育种方法的研究较 少。利用根瘤菌的运移通道改变种子内生根瘤菌比例的研究尚处初步阶段，对如何提高种 子内目标根瘤菌的数量，如何将目标根瘤菌与首猜良种精准高效组合，也尚属空白。故探索 提高首猜植株及种子内生根瘤菌数量，通过外源物质的干扰来促进大量目标根瘤菌运移并 定殖于首猜植株及种子内，实现优良根瘤菌与优良首猜品种的精准高效组合成为必然。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种目标根瘤菌在首猜植 株体内运移和定殖的促进方法。[000引为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为:一种目标根瘤菌在首猜植株体内 运移和定殖的促进方法，包括W下步骤： 1)选择菌株:选取的巧光标记根瘤菌I^iizobium meliloti .GN5f (R.GN5f)，其原始菌株 Rhizobium meliloti.GN5(R.GN5)为分离自甘农5号紫花首猜（Medicago sativa cv .Gannong No. 5)根瘤的优良根瘤菌株;通过Ξ亲本杂交获得含有青色巧光蛋白（CFP)的內 源巧光标记根瘤菌R.GN5f; (原始及巧光标记根瘤菌株均由甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室提供， 原始菌株已由中科院微生物研究所菌种保藏中屯、鉴定，全名为草木犀剑菌（Ensifer meliloti LZgn5)，编号为 101220,2013微检字第133号）。 2)选取植物材料:首猜材料为甘农5号紫花首猜； 3) 制备菌液:将步骤1)的菌株TY平板活化后转接入50mlTY液体培养基，28°C、180巧m/ min振荡培养至菌液光密度0〇6日血。值为0.5-1，4000巧m/min离屯、5min，抛去上清液后用等体 积的无菌水冲洗菌体，并用满振荡器将其打散，最后用无菌水调制成ODsQQnm为0.5的R.GN5f 巧光标记根瘤菌液； 4) 添加苦参碱:选取的苦参碱浓度为600mg/L，含量为1.3%，无菌操作台内苦参碱溶液 用0.22WI1无菌滤膜和无菌针管过滤灭菌后，添加至培养好的菌液中，至终浓度600mg/l; 5) 接种:分别随机选取现蕾期、初花期、结芙期的首猜植株5株，根部10cm范围内挖深约 5cm坑，露出主根、侧根、毛根，将制备好的巧光标记根瘤菌液按50ml/株均匀诱灌于根部，尔 后覆±埋根;未添加苦参碱的R. GN5f接种为对照； 6) 检测时期及检测组织： a) 现蕾期~成熟期:检测根、茎、叶、花、种子； b) 开花期~成熟期:检测根、茎、叶、花雌蕊的胚珠、花雌蕊的花柱、花雌蕊的柱头、花雄 蕊的花药、花雄蕊的花丝、花瓣； C)结芙期~成熟期:检测幼嫩种子、成熟种子、芙果皮； 7) 检测方法： ①取样:分别于现蕾期、初花期、结芙期采用添加苦参碱菌液诱灌的接种方法，接种后 的5(1、15(1、30(1、60(1取样检测分析，直至种子收获，^未添加苦参碱的菌液诱灌为对照;取首 猜单株，随机分离出5-10畑1深±层的毛根，茎、叶均随机取自同一植株，且分离为上部茎、下 部茎、上部叶和下部叶、花丝、花瓣、胚珠、花柱、柱头、花药、芙果皮和种子;取样用自来水冲 洗干净后自然惊干； 芭手提紫外灯平板数量检测:根、茎、叶各称取Ig，花5朵/花序、芙果皮5个/花序、种子 5粒/花序，放入50ml无菌Ξ角瓶内，加入有效舰浓度为2500mg/L的舰伏消毒液淹没，震荡消 毒4min后无菌水冲洗5次，至Ξ角瓶内无泡沫状液体出现即可，完全消毒的组织分别置于无 菌研鉢中，加入2ml无菌水充分研磨后离屯、，离屯、转速为4000rpm/min，离屯、时间为5min，吸 取0.2ml上清液均匀涂布于根研磨液依次稀释1〇1-10 3的TY固体培养基，Ξ次重复，28°C培养 24-4化后，黑暗中手提紫外灯下记录每皿内巧光标记根瘤菌数量，巧光标记根瘤菌在手提 紫外灯下发青绿色光； ③体式巧光显微镜检测：黑白体式巧光显微镜视野下，绿光激发cfp显示白色，在检测 中，含CFP标记根瘤菌的首猜组织为白色，未检出的组织为黑色。 进一步的，上述的一种目标根瘤菌在首猜植株体内运移和定殖的促进方法，TY培 养基的制备方法为:膜蛋白腺5g/L、酵母粉3g/L、CaCh ·細2〇 1.3g/L，抑至7.0，12rC灭菌 26min〇 本专利技术的有益效果为:本专利技术提供的一种目标根瘤菌在首猜植株体内运移和定殖 的促进方法，其主要优点有： 1) 选取的目标根瘤菌R. GN5f通过Ξ亲本杂交获得，该菌株的遗传稳定性好，获得容易， 使用方便； 2) 选取的苦参碱，在600mg/L浓度下对空气源和±壤源微生物抑制，对根瘤菌无抑制作 用，反而促进根瘤菌在首猜体内的运移和定殖;且苦参碱价格低廉，对环境无毒无害； 3) 获得含苦参碱的巧光标记根瘤菌液容易，接种操作简单，耗时较短，适宜生长时期内 可随时接种，接种方便； 4) 添加苦参碱后明显促进了目标根瘤菌由根部向地上茎、叶、花、种子内运移和定殖， 为获得携带有大量目标根瘤菌种子奠定基础。【附图说明】图1为添加苦参碱接种R.GN5f在种子内定殖数量:A-紫外灯(336nm)下平板检测； B-体式巧光显微镜下观察。C-未添加苦参碱接种R. GN5f种子内未检测R. GN5f。图2为紫外灯(336nm)下检测花期胚珠内R.GN5f数量:A-单独接种;B-添加苦参碱 后接种。图3为体式巧光显微镜观察添加苦参碱接种R.GN5f在根内定殖状况:A-毛根;C-侧 根中柱;E-侧根皮层;及未添加苦参碱接种R. GN5f在根内定殖状况:B-毛根;D-侧根中柱;F-侧根皮层。【具体实施方式】 1振荡培养至菌液光密度0〇6日血111值为0.5-1，4000巧111/111；1，抛去上清液后用 等体积的无菌水本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法，其特征在于，包括以下步骤：1）选择菌株：选取的荧光标记根瘤菌Rhizobium meliloti.GN5f(R.GN5f)，其原始菌株Rhizobium meliloti.GN5(R.GN5)为分离自甘农5号紫花苜蓿(Medicago sativa cv .Gannong No.5)根瘤的优良根瘤菌株；通过三亲本杂交获得含有青色荧光蛋白（CFP）的內源荧光标记根瘤菌R.GN5f；2）选取植物材料：苜蓿材料为甘农5号紫花苜蓿；3）制备菌液：将步骤1）的菌株TY平板活化后转接入50mlTY液体培养基，28℃、180rpm/min振荡培养至菌液光密度OD600nm 值为0.5‑1，4000rpm/min离心5min，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用涡振荡器将其打散，最后用无菌水调制成OD600nm为0.5的R.GN5f荧光标记根瘤菌液；4）添加苦参碱：选取的苦参碱浓度为600mg/L，含量为1.3%，无菌操作台内苦参碱溶液用0.22μm无菌滤膜和无菌针管过滤灭菌后，添加至培养好的菌液中，至终浓度600mg/L；5）接种：分别随机选取现蕾期、初花期、结荚期的苜蓿植株5株，根部10cm范围内挖深约5cm坑，露出主根、侧根、毛根，将制备好的荧光标记根瘤菌液按50ml/株均匀浇灌于根部，尔后覆土埋根；未添加苦参碱的R.GN5f接种为对照；6）检测时期及检测组织：a）现蕾期～成熟期：检测根、茎、叶、花、种子；b）开花期～成熟期：检测根、茎、叶、花雌蕊的胚珠、花雌蕊的花柱、花雌蕊的柱头、花雄蕊的花药、花雄蕊的花丝、花瓣；c）结荚期～成熟期：检测幼嫩种子、成熟种子、荚果皮；7）检测方法：①取样：分别于现蕾期、初花期、结荚期采用添加苦参碱菌液浇灌的接种方法，接种后的5d、15d、30d、60d取样检测分析，直至种子收获，以未添加苦参碱的菌液浇灌为对照；取苜蓿单株，随机分离出5‑10cm深土层的毛根，茎、叶均随机取自同一植株，且分离为上部茎、下部茎、上部叶和下部叶、花丝、花瓣、胚珠、花柱、柱头、花药、荚果皮和种子；取样用自来水冲洗干净后自然晾干；手提紫外灯平板数量检测：根、茎、叶各称取1g，花5朵/花序、荚果皮5个/花序、种子5粒/花序，放入50ml无菌三角瓶内，加入有效碘浓度为2500mg/L的碘伏消毒液淹没，震荡消毒4min后无菌水冲洗5次，至三角瓶内无泡沫状液体出现即可，完全消毒的组织分别置于无菌研钵中，加入2ml无菌水充分研磨后离心，离心转速为4000rpm/min，离心时间为5min，吸取0.2ml上清液均匀涂布于根研磨液依次稀释101‑103的TY固体培养基，三次重复，28℃培养24‑48h后，黑暗中手提紫外灯下记录每皿内荧光标记根瘤菌数量，荧光标记根瘤菌在手提紫外灯下发青绿色光；③体式荧光显微镜检测：黑白体式荧光显微镜视野下，绿光激发cfp显示白色，在检测中，含CFP标记根瘤菌的苜蓿组织为白色，未检出的组织为黑色。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：师尚礼，苗阳阳，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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