用于制备3-羟基丙酸和其它产物的方法技术

本发明专利技术涉及经代谢工程改造的微生物菌株，如细菌菌株，其中对用于化学产物制备的丙二酰-CoA具有提高的利用率，所述化学产物包括3-羟基丙酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及经代谢工程改造的微生物，如细菌菌株，其中 对用于化学产品制备的丙二酰-CoA具有提高的利用率，所述化学产品可包括化学品3-羟基丙酸(3-HP)和由3-HP制备的产品。所述经代谢工程改造的微生物可适应于表现出对3-HP提高的耐受性。另外，进行遗传修饰以提供一种或多种3-HP生物合成途径，如包含被鉴定为3-HP耐受发生复合体(toleragenic complex)的复合体的一种或多种遗传修饰的微生物。序列表本申请包含已经通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并且其全文特此以引用的方式并入本文。创建于2010年9月24日的所述ASCII文件被命名为34246744. txt并且大小为2，228, 808字节。
技术介绍
随着石油烃产品供给下降并且其成本最终上升的情势日益为人所接受，开发和改善工业微生物系统导致化学品和燃料生产的兴趣有所增加。这些工业微生物系统可完全地或部分地取代石油烃产品对于某些化学品生产的应用。许多化学品通过这样的方式进行制备，其范围从抗生素和抗疟疾药品到精细化学品到燃料如乙醇。微生物发酵的商业目标包括目标化学产物滴度、生产速度和产率的提高。当发酵事件中的整体单位生产率提高之时，除了生产速度和其它经济因素如资金成本以外，这还可以对产率有积极影响。用于这类制备的一个候选化学品是3-轻基丙酸(“3-HP”, CAS第503_66_2号),其可被转化为广泛用于工业品和消费品的聚合物的大量基本构造模块。遗憾的是，以前用微生物合成3-HP来实现商业上可行滴度的尝试显示所使用的微生物被远低于已测定的商业可行滴度的3-HP浓度所抑制。尽管存在对通过提高特定化学产品的产量和/或生产率来改善微生物发酵的经济性的强烈兴趣，对于使用商业上可行的发酵方法在发酵微生物细胞中提高向所需目标化学产品的净转化率仍然存在着需求。更特别地，有待解决的问题包括如何在经修饰的微生物中提高单位生产率和容积生产率，例如提高至有重要经济意义的水平，所述经修饰的微生物适应于在化学产品如3-羟基丙酸(3-HP)的微生物制备路径中以丙二酰-CoA作为底物制备该化学产品
技术实现思路
根据一个实施方案，本专利技术涉及制备基于丙烯酸的消费品的方法，所述方法包括i)将碳源与微生物细胞培养物结合以制备3-羟基丙酸，其中a)所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性；或《其中所述微生物通过引入编码具有单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽的外源核酸序列进行遗传修饰导致所述生物体的丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高酶活性；或c)以高于O. 05克每克微生物细胞干重每小时的单位生产率或以高于O. 50克每升每小时的容积生产率制备所述3-羟基丙酸；ii)将所述3-羟基丙酸转化成为丙烯酸；以及iii)将所述丙烯酸加工成为消费产品。在各个方面，所述碳源具有约1.0X 10_14或更高的碳14与碳12比率。根据本专利技术的所述碳源可以主要为葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖或其组合。或者，所述碳源是甘油。 在特定的实施方案中，所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性。例如，脂肪酸合成酶的抑制剂可选自硫乳霉素、三氯生、浅蓝菌素、噻吩并二氮杂硼杂因(thienodiazaborine)、异烟肼及其类似物。本专利技术的微生物可通过引入编码具有单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽的异源核酸序列而进行遗传修饰以用于该生物体的丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高的酶活性。在各个实施方案中，所述单功能丙二酰-Cok还原酶是非NADPH依赖的。在各个实施方案中，根据本专利技术，所述3-羟基丙酸以高于0.05克每克微生物干重每小时的单位生产率或以高于O. 05克每升每小时的容积生产率进行制备。本专利技术包括其中所述细胞培养物包含经遗传修饰的微生物的实施方案。所述经遗传修饰的微生物可经修饰以具有选自以下的性状所述生物体的脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性、所述生物体的丙二酰-CoA还原酶途径中具有提高的酶活性、对3-羟基丙酸升高的耐受性、所述生物体的NADPH依赖性转氢酶途径中升高的酶活性、提高的细胞内重碳酸盐水平、所述生物体的乙酰CoA羧化酶途径中提高的酶活性及其组合。例如，所述经遗传修饰的微生物可经修饰以在所述生物体的脂肪酸合成酶途径中具有降低的酶活性。或者，所述降低的酶活性是选自下列的酶的酶活性降低β -酮脂酰基-ACP还原酶、3-羟脂酰-CoA脱水酶、烯酰基-ACP还原酶和硫酯酶。在各个不同方面，所述生物体的脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性通过引入编码诱导型启动子的异源核酸序列而产生，所述启动子可操作地连接于编码所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物的序列，或者通过引入编码所述脂肪酸合成酶途径中具有降低活性的酶或其同源物的异源核酸序列而产生。在各个不同方面，所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物是具有温度敏感性β -酮脂酰基-ACP还原酶活性或温度敏感性烯酰基-ACP还原酶活性的多肽。在多种情况下，所述经遗传修饰的微生物经修饰以用于所述生物体的丙二酰-Cok还原酶途径中提高的酶活性。在特定的实施方案中，丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中的酶活性的提高通过引入异源核酸序列而产生，所述异源核酸序列编码具有双功能丙二酰-CoA还原酶活性或单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽。所述异源核酸序列可选自与选自SEQ ID NO. 780-789的序列具有至少70%同源性的序列。在各个实施方案中，所述遗传修饰的微生物经修饰以对3-羟基丙酸具有提高的耐受性。对3-羟基丙酸耐受性的提高可发生于所述3-HP耐受发生复合体(3HPTGC)复合物的一种或多种成分中，或者其中所述3-羟基丙酸耐受性的提高是由提供所述3HPTGC的A组和B组各自的至少一种遗传修饰而导致的。所述一种或多种成分可选自CynS、CynT>AroG、SpeD、SpeE、SpeF、ThrA、Asd、CysM、IroK、IlvA及其同源物。在各个实施方案中，所述修饰是一种或多种3HPTGC阻遏基因的破坏。所述阻遏基因可选自tyrR、trpR、metJ、purR、lysR、nrdR及其同源物。所述生物体的NADPH依赖性转氢酶途径中酶活性的提高可通过引入编码多肽的异源核酸序列而产生，所述多肽与选自SEQ ID NO. 776或778的序列具有至少70%的同源性。在各个实施方案中，所述提高的细胞内重碳酸盐水平通过引入编码具有氰酸酶和/或碳酸酐酶活性的多肽的异源核酸序列而产生。所述异源核酸序列可选自与选自SEQ IDNO. 337的序列具有至少70%同源性的序列。所述生物体的乙酰CoA羧化酶途径中酶活性的提高通过引入编码多肽的异源核 酸序列而产生，所述多肽与选自SEQ ID NO. 768-775的序列具有至少70%的同源性。所述经遗传修饰的细菌可被进一步修饰以降低乳酸脱氢酶、磷酸乙酰转移酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸-甲酸裂解酶及其组合的活性。本专利技术的方法可进一步包括通过在存在叔胺的情况下将3-羟基丙酸从所述培养物中提取而将3-羟基丙酸从所述细胞培养物中分离和/或纯化。在各种情况下，3-羟基丙酸以高于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.09.27 US 61/246,141;2010.01.27 US 61/298,844;1.一种用于制备基于丙烯酸的消费产品的方法，所述方法包括 i)将碳源与微生物细胞培养物结合用以制备3-羟基丙酸，其中 a)所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性；或 b)其中所述微生物通过引入编码具有单功能丙ニ酰-CoA还原酶活性的多肽的外源核酸序列进行遗传修饰导致所述生物体的丙ニ酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高的酶活性；或 c)所述3-羟基丙酸以高于O.05克每克微生物细胞干重每小时的単位生产率或以高于O. 50克每升每小时的容积生产率产生； )将所述3-羟基丙酸转化成为丙烯酸；以及 iii)将所述丙烯酸加工成为消费产品。2.根据权利要求I所述的方法，其中所述碳源具有约I.OX 10_14或更高的碳14与碳12比率。3.根据权利要求I所述的方法，其中所述碳源主要是葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖或其组合。4.根据权利要求I所述的方法，其中所述碳源是低于50%的甘油。5.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述脂肪酸合成酶抑制剂选自硫乳霉素、三氯生、浅蓝菌素、噻吩并ニ氮杂硼杂因、异烟肼及其类似物。7.根据权利要求I所述的方法，其中所述微生物通过引入编码具有单功能丙ニ酰-CoA还原酶活性的多肽的外源核酸序列进行遗传修饰导致所述生物体的丙ニ酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高的酶活性。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述单功能丙ニ酰-CoA还原酶是非NADPH依赖的。9.根据权利要求I所述的方法，其中以高于O.05克每克微生物细胞干重每小时的单位生产率或以高于O. 05克每升每小时的容积生产率制备所述3-羟基丙酸。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞培养物包含经遗传修饰的微生物。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述经遗传修饰的微生物可经修饰以具有选自以下的性状所述生物体的脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性、所述生物体的丙ニ酰-CoA还原酶途径中提高的酶活性、对3-羟基丙酸提高的耐受性、所述生物体的NADPH依赖性转氢酶途径中提高的酶活性、提高的细胞内重碳酸盐水平、所述生物体的こ酰CoA羧化酶途径中提高的酶活性及其组合。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述经遗传修饰的微生物经修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述降低的酶活性是选自以下的酶的酶活性降低β -酮脂酰基-ACP还原酶、3-羟脂酰CoA脱水酶、烯酰基-ACP还原酶和硫酯酶。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物体的脂肪酸合成酶途径中所述降低的酶活性通过引入编码诱导型启动子的异源核酸序列而产生，所述启动子可操作地连接于编码所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物的序列，或者通过引入编码所述脂肪酸合成酶途径中具有降低活性的酶或其同源物的异源核酸序列而产生。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物是具有温度敏感性β -酮脂酰基-ACP还原酶或温度敏感性烯酰基-ACP还原酶活性的多肽。16.根据权利要求11所述的方法，其中经遗传修饰的微生物经修饰导致所述生物体丙ニ酰-CoA还原酶途径中提高的酶活性。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述丙ニ酰-CoA还原酶(mcr)途径中的酶活性的所述提高通过弓I入编码具有双功能丙ニ酰-CoA还原酶活性或单功能丙ニ酰-CoA还原酶活性的多肽的异源核酸序列而产生。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述异源核酸序列选自与选自SEQIDNO. 780-789的序列具有至少70%同源性的序列。19.根据权利要求11所述的方法，其中所述经遗传修饰的微生物经修饰导致对3-羟基丙酸的提高的耐受性。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述对3-羟基丙酸耐受性的提高发生于3-HP耐受发生复合体(3HPTGC)复合物的一种或多种组分中，或者其中所述对3-羟基丙酸耐受性的提高由提供所述3HPTGC的A组和B组各自的至少ー种遗传修饰而导致。21.根据权利要求20所述的方法,其中所述ー种或多种组分选自CynS、CynT>AroG>SpeD、SpeE、SpeF、ThrA、AscU CysM、IroK、IlvA 及其同源物。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述修饰是对ー种或多种3HPTGC阻遏基因的破坏。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述阻遏基因选自tyrR、trpR、metj、purR、lysR、nrdR及其同源物。24.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物体NADPH依赖性转氢酶途径中提高的酶活性通过引入编码与选自SEQ ID NO. 776或778的序列具有至少70%同源性的多肽的异源核酸序列而产生。25.根据权利要求11所述的方法，其中所述提高的细胞内重碳酸盐水平通过引入编码具有氰酸酶和/或碳酸酐酶活性的多肽的异源核酸序列而产生。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述异源核酸序列选自与选自SEQID NO. 337的序列具有至少70%同源性的序列。27.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物体こ酰CoA羧化酶途径中提高的酶活性通过引入编码与选自SEQ ID NO. 768-775的序列具有至少70%同源性的多肽的异源核酸序列而产生。28.根据权利要求11所述的方法，其中所述经遗传修饰的细菌被进ー步修饰以降低乳酸脱氢酶、磷酸こ酰转移酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸甲酸裂解酶及其组合的活性。29.根据权利要求I所述的方法，其中在步骤(i)后，所述方法进ー步包括通过在存在叔胺的情况下将3-羟基丙酸从所述培养物中提取而将3-羟基丙酸从所述细胞培养物中分离和/或纯化。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述3-羟基丙酸以高于O.05克每克微生物细胞干重每小时的単位生产率或以高于O. 50克每升每小时的容积生产率产生。31.根据权利要求I所述的方法，其中所述消费产品选自尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述消费产品是尿布。33.生物产生的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸根据权利要求1-32中任一项产生。34.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸基本上不含化学催化剂。35.根据权利要求34所述的3-羟基丙酸，其中所述化学催化剂是基于钥和/或钒的催化剂。36.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸具有约1.0X10_14或更高的碳14与碳12比率。37.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸包含低于约10%的源自石油的碳。38.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸包含与其制备方法相关的残留量的有机物质。39.根据权利要求38所述的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸包含其量介于所述3-羟基丙酸的百万分之I与百万分之1，000之间的残留量有机物质。40.一种丙烯酸，其由根据权利要求33-39中任一项的3-羟基丙酸制备。41.一种聚合物，其使用根据权利要求40的丙烯酸制备。42.一种消费产品，其使用根据权利要求40的丙烯酸制备。43.根据权利要求42所述的消费产品，其中所述消费产品选自尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。44.根据权利要求43所述的消费产品，其中所述消费产品是尿布。45.一种用于生物生产权利要求40的丙烯酸的系统，所述系统包括 对生物质进行糖化的罐； 用于将糖化产物输送至发酵罐的管线，任选地经过预发酵罐输送； 适用于微生物细胞培养的发酵罐； 用于从所述发酵罐将内容物排放至提取和/或分离容器的管线； 适用于将3-羟基丙酸从细胞培养物废料中移除的提取和/或分离容器； 用于将3-羟基丙酸转移至脱水容器中的管线；以及 适用于将3-羟基丙酸转化成为丙烯酸的脱水容器。46.根据权利要求45所述的系统，其进一步包括一个或多个预发酵罐、蒸馏塔、离心容器、反萃取柱、混合容器或其组合。47.根据权利要求45所述的系统，其中所述系统具有至少每年I吨丙烯酸的最低产能。48.一种经遗传修饰的微生物，其中所述微生物能够以选自高于O. 05g/gDCW-hr、O. 08g/gDCff-hr> 高于 O. Ig/gDCff-hr> 高于 O. 13g/gDCff-hr> 高于 0. 15g/gDCff-hr> 高于O. 175g/gDCW-hr、高于 O. 2g/gDCW_hr、高于 O. 25g/gDCW_hr、高于 O. 3g/gDCW_hr、高于O. 35g/gDCW-hr、高于 O. 4g/gDCW_hr、高于 O. 45g/gDCW_hr 或高于 O. 5g/gDCW_hr 的速率的比速率产生3-羟基丙酸。49.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酸激酶活性的遗传修饰。50.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酰磷酸转移酶活性的遗传修饰。51.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性、乙酸激酶活性和乙酰磷酸转移酶活性的遗传修饰。52.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸甲酸裂解酶活性的遗传修饰。53.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸氧化酶活性的遗传修饰。54.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性的遗传修饰。55.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和提高β -酮脂酰基-ACP合成酶活性、乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·D·林奇，R·T·吉尔，T·瓦内克利普斯科布，
申请(专利权)人：OPX生物工艺学公司，科罗拉多大学董事会法人，
类型：发明
国别省市：