一种纤维素降解菌群的宏基因组的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种纤维素降解菌群的宏基因组的提取方法。本发明专利技术提供了一种纤维素降解菌群宏基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：对纤维素分解菌群依次进行菌体破壁、有机溶液抽提DNA、异戊醇沉淀DNA和溶解DNA，得到宏基因组DNA；本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术通过在提取前采用高盐溶液进行洗脱，并通过加入溶菌酶和机械匀浆强化细胞破壁，并通过蛋白酶K破壁，不仅使微生物细胞壁更易破碎，DNA分子更易释放，同时有效保证了过程的可重复性，进而保证了提取的宏基因组DNA片段完整性、纯度和菌群结构完整性。本发明专利技术为天然纤维素利用菌群的研究和应用,以及微生物分子生态学研究提供了有效的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。本专利技术提供了一种纤维素降解菌群宏基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：对纤维素分解菌群依次进行菌体破壁、有机溶液抽提DNA、异戊醇沉淀DNA和溶解DNA，得到宏基因组DNA；本专利技术的实验证明，本专利技术通过在提取前采用高盐溶液进行洗脱，并通过加入溶菌酶和机械匀浆强化细胞破壁，并通过蛋白酶K破壁，不仅使微生物细胞壁更易破碎，DNA分子更易释放，同时有效保证了过程的可重复性，进而保证了提取的宏基因组DNA片段完整性、纯度和菌群结构完整性。本专利技术为天然纤维素利用菌群的研究和应用,以及微生物分子生态学研究提供了有效的技术支撑。【专利说明】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种纤维素降解菌群的宏基因组的提取方 法。
技术介绍
木质纤维素是自然界中产量最大的多糖物质，广泛存在于森林、草原和农田中。其 产量丰富，价格低廉，而且多以农业和工业废弃物形式存在，是理想的生物能源类物质的生 产原料。研究表明，以木质纤维素为原料的生物能源生产工艺不仅能够实现农业废弃物的 再利用，而且可有效避免能源生产与粮食资源间的矛盾，成为最具潜力的生物能源工业化 生产途径。 然而，由于木质纤维素组成复杂、结构致密，其水解为可利用糖的过程需要多种酶 系的协同作用，导致利用成本居高不下。自然界中纤维素降解细菌菌群由多种细菌长期共 生而成，能够快速高效地降解积累的大量木质纤维素。其中，木质纤维素降解菌能提供极为 丰富的纤维素酶系和半纤维素酶系，而非纤维素降解菌株能提供的辅助因子，帮助纤维素 快速降解。近年来的研究显示，利用菌群发酵纤维素有望实现一步法纤维素生物燃料的生 产，进而较大程度的降低生产成本。因此，揭示天然菌群转化木质纤维素的作用机理，成为 本领域研究的重要内容。 目前，已经建立了多种研究菌群作用机理的方法。其中，宏基因组测序是相对成熟 的手段之一，已成功应用在多种菌群样品的结构分析之中，包括土壤、水体等环境样品和肠 道菌群、瘤胃、沼气种泥等功能样品。但是，由于纤维素菌群的自身特点，增加了其基因组 DNA的提取难度，因此，尚未建立完善的纤维素菌群的宏基因分析技术。 影响天然纤维素菌群宏基因组提取效果的因素主要包括如下三点：第一，纤维素 菌群中的菌株多通过纤维小体结构与纤维素微丝紧密结合，以"纤维素_酶-菌体"的交联形 式存在于发酵液中，这种交联会显著影响菌体的破壁和基因组提取，导致获得的DNA无法真 实反映菌群组成，影响菌群结构分析的准确性;第二，菌群发酵纤维素过程中会在细胞外积 累大量的代谢产物，包括有机酸、有机醇和表面活性剂在内的多种物质，这些物质会对基因 组提取试剂产生一定的干扰，影响DNA的提取效果;第三，菌群既包含革兰氏阴性菌又包含 革兰氏阳性菌，还存在着大量的孢子，增加了DNA提取的难度。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种纤维素降解菌群宏基因组DNA的提取方法。 本专利技术提供的方法，包括如下步骤:对纤维素分解菌群依次进行菌体破壁、有机溶 液抽提DNA、异戊醇沉淀DNA和溶解DNA，得到宏基因组DNA; 所述菌体破壁包括如下步骤： (1)将纤维素分解菌群的菌体用高盐溶液进行高盐洗涤，收集高盐洗涤后菌体； (2)将所述高盐洗涤后菌体用溶菌酶裂解，得到溶菌酶裂解后产物； (3)将所述溶菌酶裂解后产物用蛋白酶K酶解，得到蛋白酶K酶解后产物； (4)匀浆所述蛋白酶K酶解后产物，收集匀浆产物的上清液。 上述方法中，步骤(1)中，所述高盐洗涤为将所述纤维素分解菌群的菌体与所述高 盐溶液混匀，离心收集沉淀，得到洗涤后菌体； 步骤(2)中，所述裂解为将所述洗涤后菌体和溶菌酶溶液混匀后加热反应，得到溶 菌酶裂解后产物； 步骤(3)中，所述酶解为将所述溶菌酶裂解后产物和蛋白酶K溶液混匀后再次加热 反应，得到蛋白酶K酶解后产物； 步骤(4)中，所述匀浆为将所述蛋白酶K酶解后产物、玻璃珠和交联聚乙烯吡咯烷 酮溶液混合，得到混合产物，用匀浆器匀浆所述混合产物，得到匀浆产物;离心收集所述匀 浆产物，得到匀浆产物的上清。 上述方法中，所述高盐洗涤次数大于等于2。 上述方法中，步骤（1)中，所述纤维素分解菌群的菌体与所述高盐溶液等体积混 匀； 步骤(2)中，所述洗涤后菌体和所述溶菌酶溶液中酶的配比为1 g: 7，000，000U; 步骤(3)中，所述溶菌酶裂解后产物和所述蛋白酶K溶液中酶的配比为1 g: 3，900U;步骤(4)中，所述蛋白酶K酶解后产物、玻璃珠和交联聚乙烯吡咯烷酮溶液的配比 为lg:0.5g:lmL〇 蛋白酶K酶活为39U/mg，Sigma公司，产品号为P6556(粉剂）。 溶菌酶酶活为70，000U/mg，Sigma公司，产品号为62971 (粉剂）。 上述方法中，所述加热反应的条件为30-40°C反应15-60min; 所述再次加热处理为30-65 °C反应15-60min; 所述匀浆的条件为4-6m/s线速度匀浆2次，每次20-40s。 上述方法中，所述高盐溶液为浓度大于等于75.5g/l的KC1水溶液； 所述高盐洗涤后菌体和所述溶菌酶溶液的加料比为lg: 1ml; 所述溶菌酶裂解后产物和所述蛋白酶K溶液的加料体积比为1:1; 所述溶菌酶溶液由 5-15g/L 的 Na2HP〇4，l-5g/L 的 KH2P〇4,5-10g/L 的 NaCl，50-200g/ L的溶菌酶和水组成；所述蛋白酶 K 溶液由 5-15g/L 的 Na2HP〇4，l_5g/L 的 KH2P〇4,5-10g/L 的 NaCl，50-200g/L的蛋白酶K和水组成。 所述玻璃珠为直径0.1mm玻璃珠、直径0.5mm玻璃珠和1.0mm玻璃珠按照等体积混 匀得到的玻璃珠；所述交联聚乙烯吡咯烷酮溶液由质量比体积为5-15 %的PVPP、质量比体积为1 -5% 的SDS、10-100mMTris、10-100mM EDTA、10-200mMNaCl和水组成。上述方法中，所述有机溶液抽提DNA为将所述匀浆产物的上清液与酚-氯仿-异戊 醇溶液混匀，得到混合液，离心收集所述混合液的水相；所述异戊醇沉淀DNA为将所述水相与体积百分含量为50 %-70 %异戊醇水溶液混 匀，静置，离心收集沉淀，得到异戊醇沉淀后DNA;所述乙醇洗涤DNA为将所述异戊醇沉淀后DNA与体积百分含量为70%乙醇水溶液 混匀，离心收集沉淀，得到洗涤后DNA; 所述溶解DNA为用溶解液溶解所述洗涤后DNA，得到宏基因组DNA。上述方法中，所述匀浆产物的上清液和所述酚-氯仿-异戊醇溶液的体积比为1:1; 所述水相和所述体积百分含量为50%_70%异戊醇水溶液的体积比为1:1;所述异戊醇沉淀后DNA与所述体积百分含量为70%乙醇水溶液的体积倍为1:3-5。 上述方法中，所述酚-氯仿-异戊醇溶液为酚、氯仿、异戊醇按照体积比为25:24:1 混匀得到的溶液；所述溶解液为水。 和/或，所述离心的条件均为14,000g离心10min-30min; 所述静置的条件为-4_20°C静置0.5_6h。 上述方法中，所述纤维素降解菌群为稳定降解木质纤维素原料的天然纤维素降解 菌群。 所述纤维素降解菌群的菌体为将纤维素降解菌群10%接种量接种在菌群富集培 养基，置于50°C静置培养3天本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纤维素降解菌群宏基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：对纤维素分解菌群依次进行菌体破壁、有机溶液抽提DNA、异戊醇沉淀DNA和溶解DNA，得到宏基因组DNA；所述菌体破壁包括如下步骤：(1)将所述纤维素分解菌群的菌体用高盐溶液进行高盐洗涤，收集高盐洗涤后菌体；(2)将所述高盐洗涤后菌体用溶菌酶裂解，得到溶菌酶裂解后产物；(3)将所述溶菌酶裂解后产物用蛋白酶K酶解，得到蛋白酶K酶解后产物；(4)匀浆所述蛋白酶K酶解后产物，收集匀浆产物的上清液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：闫建斌，杜然，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11