一种制备人凝血酶原复合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种人凝血酶原复合物的制备方法，它包括如下步骤：(1)预纯化；(2)S/D病毒灭活；(3)精制纯化；(4)配制，除菌，分装，冻干，干热处理，即可。本发明专利技术方法FIX回收率高达约58‑67万IU/吨血浆，且对人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且无需采用柱层析等高成本的方法，成本低廉，应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种人凝血酶原复合物的制备方法，它包括如下步骤：(1)预纯化；(2)S/D病毒灭活；(3)精制纯化；(4)配制，除菌，分装，冻干，干热处理，即可。本专利技术方法FIX回收率高达约58?67万IU/吨血浆，且对人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且无需采用柱层析等高成本的方法，成本低廉，应用前景良好。【专利说明】
本专利技术属于血液制品领域，具体涉及。
技术介绍
人凝血酶原复合物，主要用于治疗先天性和获得性凝血因子n、W、K、X缺乏症 (单独或联合缺乏)包括：1.凝血因子IX缺乏症（乙型血友病），以及n、w、x凝血因子缺乏 症;2.抗凝剂过量、维生素K缺乏症;3.肝病导致的出血患者需要纠正凝血功能障碍时;4.各 种原因所致的凝血酶原时间延长而拟作外科手术患者，但对凝血因子V缺乏者可能无效;5. 治疗已产生因子珊抑制物的甲型血友病患者的出血症状;6.逆转香豆素类抗凝剂诱导的出 血。 人凝血酶原复合物是从健康人血浆中分离的血浆制品，合适的反应条件和保护剂 的使用对工艺中FIX收率有显著性影响，但是目前制备人凝血酶原复合物的方法存在FIX回 收率低，对血浆中其他有效成分影响大的问题。 如，魏舒等，"冻干人凝血酶原复合物的生产工艺研究"，中国输血杂志，2008，21 :282~284公开了一种人凝血酶原复合物生产工艺，制品经过S/D病毒灭活时未采取合 适的保护剂，凝血因子II、VII、IX和X活性回收率分别损失20 %左右。 公告号10 2151289B的专利申请公开了 ，其FIX 回收率仅为45~49万IU/吨血浆，且未采取降低人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附 的步骤，导致宝贵的血浆资源浪费。 公开号为104109202A的专利申请也公开了，其 FIX回收率较高，但是其工艺中多步澄清过滤增加操作难度和生产成本，并且按照柱床体积 与上样的血浆量的比例为1:10~1:50来计算，要实现1吨血浆/批的处理，使用凝胶量为20 ~100L，按Capto DEAE市场价格计算，凝胶成本为300~1500万元，远远高于每吨血衆实现 人凝血酶原复合物价值，因此，成本太高，实际应用价值不大。 因此，需要提供一种成本低廉的、FIX回收率高的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种人凝血酶原复合物的制备方法。 去冷沉淀上清血浆:即去冷沉淀血浆。 本专利技术人凝血酶原复合物的制备方法，它包括如下步骤： (1)预纯化 取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为10~15°C和7.0~7.4，按照每1L上清 血浆使用1.4~1.6g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平 衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析； (2)S/D 病毒灭活； (3)精制纯化 将制品温度和pH分别调节至10~15°C和7.0~7.4，按照每1L上清血浆使用1.2~ 1.5g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤 缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析； (4)干热处理，即可。 步骤（1)和步骤(3)中，平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液均是含有NaCl和枸 橼酸钠的溶液。 优选地， 平衡缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0 ? 08mol/L、0 ? Olmol/L; 洗涤缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0.17~0.23mol/L、0.0 lmol/L; 洗脱缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为2.0mol/L、0.015mol/L。 步骤（1)中，吸附的时间为45~60min。 步骤（1)中，透析采用的透析液是温度为15~25°C、pH为7.0~7.4的浓度为 0.015mol/L的枸橼酸钠溶液。 步骤(2)中，所述S/D病毒灭活的方法是:取步骤（1)制得的制品，加入肝素钠，再加 入Tween-80和TNBP使Tween-80和TNBP的最终浓度分别为1 % (w/v)和0.3% (v/v)，待制品温 度达到24°C开始计时，控制温度24~26°C，时间6小时。其中，肝素钠的加入量为1~3IU/ml 制品。 步骤(3)中，吸附的时间为30~60min。 步骤(3)中，透析采用的透析液是含0. lmo 1/L NaCl、0.015mo 1/L枸橼酸钠、20g/L 甘氨酸和5g/L盐酸赖氨酸的溶液，其温度为15~25°C、pH为6.9~7.1。步骤(4)中，配置时加入肝素钠，肝素钠加入量是制品中FIX含量的0.1~0.3倍。 步骤(4)中，干热处理的条件是80°C干热处理72小时。 本专利技术方法FIX回收率高达约58-67万IU/吨血浆，且对人血白蛋白和免疫球蛋白 的非特异性吸附少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且无需采用柱层析等高成本的方法，成 本低廉，应用前景良好。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容 所实现的技术均属于本专利技术的范围。【附图说明】 图1为人凝血酶原复合物的制备流程图。【具体实施方式】 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒 说明书选择。实验试剂：枸橼酸钠，氯化钠，甘氨酸，盐酸赖氨酸，DEAE Sephadex A50凝胶均为 市售品。实施例1本专利技术人凝血酶原复合物的制备方法 一、制备方法 ⑴预纯化将原料血浆融化，离心去除冷沉淀，将冷上清血浆升温至10°C，用醋酸缓冲液将pH 调整到7.0。按1.4g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀后的凝胶，吸附时间为45min。 收集凝胶，依次采用平衡、洗涤和洗脱缓冲液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进 行超滤透析，完成后计量制品的体积。 (2)S/D病毒灭活按1 IU/ml制品比例加入肝素钠后，再根据制品的体积加入S/D储备液，使最终 Tween~80和TNBP的浓度分别为1 %和0.3%。待制品温度达到24°C开始计时，控制温度24~ 26°C，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次。 (3)精制纯化 将制品温度和pH分别调整到10°C和7.0,按1.2g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例 添加溶胀后的凝胶，吸附时间为30min。收集凝胶，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱缓冲液液 处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，透析结束后，对制品进行计量，并 抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.1IU/IU FIX加 入肝素钠，混匀。除菌分装后的制品应立即冻干。 (4)干热处理 冻干后的制品经80°C、72小时干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完 成后即得人凝血酶原复合物成品，检定结果如表1所示。 其中，平衡液含0 ? 08mol/L NaCl和0 ? 01mol/L枸橼酸钠，温度值为10 °C，pH值为 7.0； 洗涤液含0 ? 17mol/L NaCl和0 ?本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)预纯化取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为10～15℃和7.0～7.4，按照每1L上清血浆使用1.4～1.6g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析；(2)S/D病毒灭活；(3)精制纯化将制品温度和pH分别调节至10～15℃和7.0～7.4，按照每1L上清血浆使用1.2～1.5g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析；(4)配制，除菌，分装，冻干，干热处理，即可。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余伟，鲁涛，牟蕾，李伟，王黔川，
申请(专利权)人：成都蓉生药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川;51