本发明专利技术涉及一种可在乳酸乳球菌表面展示表达异源基因的载体及其制备方法与应用。该载体具有序列表中SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，含启动子Pnis、lysM基因、分泌信号肽序列ssusp45、多克隆酶切位点、复制子repA和repC元件。该载体的构建方法：应用PCR技术扩增乳酸乳球菌NZ3900菌株自溶素（AcmA）锚定区基因lysM，将lysM与载体pNZ8110经酶切后进行连接，连接产物用于转化E.coli?MC1061菌株，阳性转化菌经酶切和测序鉴定后，提取重组质粒，得到本发明专利技术提供的表达载体。该载体功能：将外源基因与该载体连接，转入乳酸乳球菌NZ3900中，经乳酸链球菌素(nisin)诱导可实现外源基因的表达和表达蛋白与宿主细胞壁的结合。该载体可用于包括疫苗抗原在内的外源蛋白的表达，具有广泛的应用范围。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种可在乳酸乳球菌中表达外源蛋白、且使表达蛋白展示于菌体表面的表达载体，同时还涉及该载体的制备方法与应用。
技术介绍
目前，对于一些消化道病原体感染，例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)感染，由于采用抗菌素治疗可使细菌耐药性增加、且对重复感染无预防作用，故对这类疾病更有效的防治只能寄希望于疫苗的研究成功。在疫苗研究中，口服疫苗以其免疫途径安全、合理、方便等优点而受到关注。但是，目前口服疫苗研究发展因缺乏理 想的疫苗载体而受到制约 现有研究多米用减毒伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)作为口服疫苗载体，结果显示，虽然此类候选疫苗株在动物体内可产生较好的免疫效果，但由于存在安全性问题，而不适用于婴幼儿、老年人及免疫缺陷者。探讨更安全有效的口服疫苗载体是该领域研究的发展趋势，对口服疫苗的研制起关键性作用。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, L. lactis)是乳酸菌类的一个菌种，在食品加工中的应用已有悠久的历史，属于食品级益生菌，安全性十分可靠，而且其生长迅速，易于培养，遗传背景和调控机制相对清楚，具有用作口服疫苗载体的很大潜力。目前应用最为广泛的乳酸菌表达系统是 NICE (Ni s in-control led expression)系统。在此系统中，NisK是敏感激酶，NisR是反应蛋白，当有微量的乳酸链球菌素nisin加入该表达系统时，即可被蛋白激酶NisK识别并与之结合,而结合nisin的NisK通过磷酸化激活NisR,激活的NisR蛋白即诱导连接于nisA启动子后的目的基因表达。为了使用NICE系统进行基因表达，受体蛋白和反应因子基因即nisK和nisR被分离并整合到合适宿主菌的基因组中，而nisA启动子基因则整合到质粒上，当目的基因克隆到启动子下游且质粒转化入nisKR阳性菌株中，在宿主菌生长至对数生长期时加入微量nisin即可诱导目的基因表达。NICE 表达系统具有以下优点诱导剂nisin在食品工业中作为防腐剂应用已有多年，被认为是具有食品级安全性的添加剂；nisin价格低廉,而且用量很小；加入nisin后目的蛋白能达到较高的表达水平。。正是由于NICE系统的上述优点，该系统已成为乳酸菌类最有前途的诱导表达系统之一。在NICE表达系统中，PNZ8149与pNZ8110为常用的两个表达载体，采用的宿主菌NZ3900染色体基因组含有的nisK和nisR基因，载体pNZ8110和pNZ8149均含有nisA启动子PnisA。应用pNZ8110或pNZ8149为载体，将外源基因整合到启动子PnisA下游后，加入诱导剂即可诱导外源蛋白在乳酸乳球菌胞内或分泌表达，但不具有在菌体表面展示表达外源蛋白的功能。近年研究表明，作为口服疫苗载体，若能将表达的抗原展示于菌体表面则更有利于刺激胃肠黏膜免疫系统，而产生更好的免疫效果。因此，作为口服疫苗抗原表达载体，PNZ8110或PNZ8149无表面展示表达外源蛋白功能，是一种技术缺陷。这不仅影响了该乳酸菌表达系统的应用范围，也对亟需疫苗载体的口服疫苗研究发展不利。应用分子生物学技术，将PNZ8110或pNZ8149改造成具有在菌体表面展示表达外源蛋白功能的新载体，是口服疫苗研制中技术发展的需要。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的提供了一种可表面展示表达外源蛋白的乳酸乳球菌表达载体。同时，本专利技术的目的还提供了该载体的构建方法与应用。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案采用了一种乳酸乳球菌表达载体，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO. I所示核苷酸序列存在至少95%同源性，或与SEQ ID NO. I所示核苷酸序列存在至少90%同源性。本专利技术提供的乳酸乳球菌表达载体pNZ8110_lysM(SEQ ID NO. I)，其含有以下元件来自乳酸乳球菌NZ3900基因组的IysM基因序列(SEQ ID NO. 2)和来自菌株乳酸乳球菌表达载体pNZ8110(SEQ ID NO. 3)的启动子Pnis、分泌信号肽序列ssusp45、多克隆酶切位点、复制子repC和repA及氯霉素抗性基因cm。IysM元件是乳酸乳球菌自溶素(AcmA)锚定区基因序列，具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。外源基因插入表达载体pNZ81 IO-IysM多克隆位点后,可与分泌信号肽序列ssusp45、IysM基因融合表达。ssusp45序列编码的信号肽可引导融合蛋白分泌至胞外,而IysM基因编码的锚定肽具有与细胞壁结合功能，因此融合蛋白可与细胞壁结合，而实现外源蛋白在菌体表面的展示表达。本专利技术的技术方案还采用了一种DNA序列，包含有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。本专利技术的技术方案还采用了一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)MC1061/pNZ8110-lysM，于2012年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6116。另外，本专利技术的技术方案还米用了一种乳酸乳球菌表达载体pNZ8110_lysM的构建方法，包括以下步骤 I)提取乳酸乳球菌NZ3900菌株的基因组DNA，根据Genbank数据库IysM基因序列(Genbank:AM406671. I)设计PCR引物，PCR扩增得到IysM基因；2)分别双酶切IysM及表达载体pNZ8110，回收纯化酶切片段，并用T4DNA连接酶进行定向连接，连接产物用于转化大肠杆菌Escherichia coli MC1061 ；3)通过氯霉素抗性筛选和PCR、酶切及测序鉴定，得到阳性转化菌株；4)培养得到的阳性转化菌，提取重组质粒，该重组质粒即为构建的乳酸乳球菌表达载体，将其命名为pNZ8110-lysM。本专利技术提供的乳酸乳球菌表达载体的构建方法中，用于扩增IysM基因的PCR引物是根据 GenBank 数据库中 L. lactis NZ3900 菌株的 IysM 基因序列(Genbank: AM406671. I),应用生物软件Primer 5. 0设计的，上游引物Pl的核苷酸序列为5’ -ACATGCATGCGACGGACGGAGCTTCTTCAGC-3’ (SEQ ID NO. 4);下游引物 P2 的核苷酸序列为:5，-GCTCTAGATTATGAACCACCTGAATTTGTAGAAG-3’ (SEQ ID NO. 5)。在上游引物5，端含Sph I酶切位点，在下游引物5，端含Xba I酶切位点。本专利技术提供的L. Iactis表达载体的构建方法中，所述的分别双酶切IysM和表达载体pNZ8110所采用的内切酶为Sph I和Xba I。本专利技术提供的L. Iactis表达载体pNZ8110_lysM的构建方法中，所述的用IysM与pNZ8110连接产物转化E. coli MC1061菌株的方法为常规大肠杆菌CaCl2转化法;用含氯霉素(10 u g/ml)的LB培养基筛选阳性转化菌，从平板上刮取阳性转化菌菌落，培养并提取质粒进行限制性酶切及测序鉴定，鉴定结果显示序列正确的重组质粒，即为构建的L.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可在乳酸乳球菌表面展示表达异源基因的载体，其特征在于：包含有SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：段广才，张荣光，程文滨，范清堂，张卫东，郗园林，陈帅印，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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